非小細胞肺癌ERCC1表達的轉(zhuǎn)化研究現(xiàn)狀

崔少華 姜麗巖

肺癌分子標志物研究是轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的熱點問題，作為世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，肺癌嚴重威脅著人們的健康[1]。其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）約占肺癌總數(shù)的80%。切除修復(fù)交叉互補基因1（excision repair cross-complementation 1, ERCC1）是重要的肺癌分子標志物，NSCLC的ERCC1表達的轉(zhuǎn)化研究取得較大進展。本文綜述了ERCC1表達轉(zhuǎn)化研究中的最新進展以及存在的問題，并試圖據(jù)此提出合理化建議，為促進ERCC1早日向臨床轉(zhuǎn)化、指導(dǎo)NSCLC患者個體化治療方案的制定提供依據(jù)。

1 ERCC1表達與NSCLC

ERCC1位于人類染色體19q13.2，是一種單鏈DNA核酸內(nèi)切酶，是核苷酸切除修復(fù)（nucleotide-excision repair,NER）途徑的限速酶，而NER途徑在機體DNA損傷修復(fù)過程中發(fā)揮著重要作用。ERCC1表達可在一定水平上反映DNA修復(fù)能力（DNA repair capability, DRC）。機體DRC降低，使得細胞DNA損傷不能及時得到修復(fù)，可增強肺癌易感性。相反，ERCC1過表達可導(dǎo)致DNA-鉑類加合物的修復(fù)，產(chǎn)生鉑類耐藥。目前，鉑類聯(lián)合三代化療新藥是晚期NSCLC患者的主要治療方案，鉑類在腫瘤細胞內(nèi)水解成雙氯雙氨鉑，然后形成DNA-鉑類加合物，阻止腫瘤細胞DNA的復(fù)制，發(fā)揮其細胞毒性作用。

轉(zhuǎn)化研究結(jié)果表明，ERCC1表達有作為NSCLC預(yù)后或鉑類療效預(yù)測的潛力，但結(jié)論并未達成一致，有必要開展進一步的研究來解決ERCC1表達轉(zhuǎn)化研究中存在的一些問題。

2 ERCC1表達轉(zhuǎn)化研究中存在的問題

2.1 ERCC1表達的測定方法 目前用于測定ERCC1表達水平的方法主要包括免疫組織化學(xué)技術(shù)（immunohistochemistry, IHC）和實時定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR）。IHC和RT-PCR分別測定ERCC1蛋白水平和mRNA水平。IHC較為經(jīng)濟，能迅速檢測腫瘤組織ERCC1蛋白表達，具有較廣泛的適用性，但缺乏可重復(fù)性和客觀性。RT-PCR是定量測定ERCC1 mRNA表達水平最敏感的方法，但該技術(shù)復(fù)雜、需組織樣本量多、成本高，實驗室普遍采用有一定困難。有研究證實，ERCC1 mRNA表達水平與蛋白表達水平間存在差異，造成兩種檢測方法結(jié)果不一致。Tepeli等[2]研究了91例NSCLC腫瘤標本ERCC1在DNA、mRNA和蛋白三個水平狀態(tài)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)ERCC1 DNA和mRNA表達存在明顯相關(guān)（r=0.662），而mRNA和蛋白表達之間沒有明顯相關(guān)性（r=-0.013）。Zheng等[3]檢測44例早期術(shù)后NSCLC患者的腫瘤標本，發(fā)現(xiàn)ERCC1 mRNA表達水平和ERCC1蛋白表達水平無明顯相關(guān)性。Ozdemir等[4]采用IHC法對83例IIIb期或IV期NSCLC患者治療前腫瘤活檢標本進行ERCC1蛋白水平檢測，患者均接受鉑類化療，且化療前未接受過手術(shù)或放射治療，結(jié)果表明ERCC1蛋白表達陽性者和陰性者的化療療效、無進展生存期（progression-free survival,PFS）、總生存期（overall survival, OS）的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Ren等[5]采用RT-PCR法對100例IIIb期或IV期NSCLC患者ERCC1 mRNA水平進行檢測，患者接受鉑類和三代新藥方案治療，結(jié)果表明ERCC1 mRNA高表達者OS短。

這些結(jié)果的差異，可能與ERCC1表達測定方法不同有關(guān)。哪一種方法更適用于臨床檢測，還需進一步研究確定。Vilmar等[6]使用IHC和RT-PCR兩種方法檢測33例NSCLC患者手術(shù)切除的腫瘤組織包括ERCC1在內(nèi)的4種基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達，結(jié)果表明與RT-PCR相比，IHC檢測能力更強。Chen等[7]認為，對接受鉑類化療患者ERCC1表達水平的檢測，IHC要好于RT-PCR。因為在鉑類耐藥機制中，ERCC1基因蛋白水平產(chǎn)物在修復(fù)DNA-鉑類加合物導(dǎo)致的DNA損傷過程中發(fā)揮了主要作用，兩種ERCC1表達檢測方法的關(guān)系和適用性有待進一步研究。

需要指出的是，目前IHC測定ERCC1蛋白表達水平的研究，大多采用鼠單克隆抗體8F1，Olaussen等[8]近來的一項研究表明自2006年以來，某些原因可能使8F1抗體的特異性發(fā)生了改變。Ma等[9]通過高密度蛋白微陣列芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)目前因8F1抗體會與一種RCYT1A蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)而已經(jīng)不再適用于ERCC1蛋白表達水平的檢測。他們的研究同時發(fā)現(xiàn)了兩個新產(chǎn)生的單克隆抗體4F9和2E12，對ERCC1蛋白特異性強，將來可能會替代8F1作為使用IHC方法檢測ERCC1蛋白表達水平的特異性抗體。

Friboulet等[10]對ERCC1蛋白的四種亞型進行功能性檢測，他們發(fā)現(xiàn)僅ERCC1-202蛋白亞型與DNA修復(fù)途徑有關(guān)，DNA修復(fù)酶缺乏互補基因F（xeroderma pigmentosum complementation group F, XPF）的穩(wěn)定性需要ERCC1-202蛋白亞型的表達，而其余三種亞型與DNA修復(fù)途徑無關(guān)。通過選擇性剪切，ERCC1基因產(chǎn)生4種分子量的mRNA，不同ERCC1 mRNA產(chǎn)生不同的ERCC1蛋白。而僅有11 kb的mRNA表達出39×109分子量的蛋白質(zhì)時，才表現(xiàn)為對鉑類耐藥，這種功能性蛋白亞型在腫瘤細胞DNA的NER途徑中起主要作用。而目前研究使用的抗體尚無法辨別ERCC1基因產(chǎn)生的三種非功能性蛋白和一種功能性蛋白，檢測得到的是ERCC1總蛋白表達水平[8,10]，因此，如果我們能找到一種能夠特異檢測功能性ERCC1蛋白亞型的抗體，將可以通過功能性ERCC1蛋白亞型表達水平更準確地預(yù)測NSCLC患者對鉑類藥物的敏感性。

2.2 ERCC1表達高低劃分點的確定 Ozdemir等[4]采用IHC法測定ERCC1蛋白表達，他們根據(jù)染色的范圍和強度，將染色范圍分為0分為無，1分為1%-9%，2分為10%-49%，3分為≥50%；染色強度分為0分為無，1分為弱，2分為中等，3分為強。計算染色強度與染色范圍的比值為H評分。將所有H評分的中位數(shù)作為ERCC1表達高低或陽性/陰性標準的劃分點。他們采用IHC法對83例IIIb期或IV期接受鉑類方案治療的NSCLC患者治療前腫瘤活檢標本進行ERCC1蛋白水平檢測，結(jié)果表明ERCC1蛋白表達陽性者和陰性者的化療療效、PFS、OS的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Holm等[11]的實驗同樣采用IHC法，但他們將染色范圍分為0分為無，0.1分為1%-9%，0.5分為10%-49%，1分為≥50%。計算H評分，并將H評分高于0者定義為ERCC1高表達。他們對163例接受順鉑和吉西他濱治療的NSCLC患者ERCC1蛋白表達和中位OS的關(guān)系進行了評估，發(fā)現(xiàn)ERCC1低表達的男性患者中位OS長。Booton等[12]采用RT-PCR法測定ERCC1 mRNA表達水平，用入組的66例NSCLC患者ERCC1 mRNA表達水平中位數(shù)作為高低表達劃分標準，他們對入組患者ERCC1 mRNA表達和鉑類化療反應(yīng)、化療毒性的關(guān)系進行評估，發(fā)現(xiàn)ERCC1 mRNA表達和化療反應(yīng)、毒性反應(yīng)之間不存在明顯關(guān)系。

Hubner等[13]的一項meta分析對23項研究的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，無論研究者采用IHC法還是RT-PCR法，ERCC1表達水平高低劃分標準差異較大。15項采用IHC法測定ERCC1蛋白表達水平的實驗中，研究者大多采用H評分劃分ERCC1高低表達水平，但標準各異。而8項采用RTPCR法測定ERCC1 mRNA表達水平的實驗中，劃分標準同樣不同。

目前，對于ERCC1表達水平劃分標準的不一致，研究者大多根據(jù)各自實驗樣本劃分高低表達水平，使得不同研究結(jié)果間的比較出現(xiàn)問題。轉(zhuǎn)化研究階段，需要統(tǒng)一劃分標準才可能使ERCC1作為分子預(yù)后和預(yù)測標志物用于臨床，因此，還需大量前瞻性分層研究來確定合適的ERCC1表達劃分標準。

2.3 不同來源標本ERCC1表達的不同 檢測ERCC1表達水平所需樣本一般來源于手術(shù)切除或組織活檢。但研究發(fā)現(xiàn)由這兩種方法取得的標本ERCC1表達水平有差異。大樣本和小樣本ERCC1表達的不同可能造成研究結(jié)果的不一致。Taillade等[14]采用IHC法比較了NSCLC患者活檢標本和相應(yīng)手術(shù)取得全部腫瘤標本中ERCC1的表達水平，發(fā)現(xiàn)對于來自同一患者的兩種標本ERCC1表達水平高度相關(guān)（r=0.83），但是并不完全一致，兩種方法對ERCC1表達陽性檢測仍存在9%的差異。27例標本中，3例手術(shù)切除標本ERCC1表達陽性而支氣管活檢結(jié)果卻呈陰性。說明活檢標本并不能完全取代全部腫瘤標本進行ERCC1表達水平檢測。Jakobsen等[15]獲得6例I期和IIa期接受胸腔鏡切除的NSCLC腺癌患者標本，每個切除標本被分成三等份并包埋在石蠟包塊中，每一包塊切下4 μm厚度的部分涂在玻片上，前后兩部分用于HE染色、組織學(xué)確診和IHC分析（包括評估所有切片腫瘤組織最佳代表部位），在每個HE著色的部分標注5個直徑約5 mm的圓形區(qū)域（標本中央和周圍四個角），采用IHC法對每個腫瘤標本的15個部位進行包括ERCC1在內(nèi)的六種蛋白表達的檢測，發(fā)現(xiàn)對于同一種分子標志物，同一標本不同部位表達存在差異，除胸苷酸合成酶外，存在33%-87%的差異。這些差異提示依據(jù)小樣本檢測分子標志物表達的局限性。

對于早期發(fā)現(xiàn)并行手術(shù)切除的NSCLC患者，手術(shù)切除病灶可作為ERCC1檢測樣本。但確診NSCLC時，大多患者已屬中晚期，失去手術(shù)治療機會，組織活檢為取得樣本的主要途徑。但用支氣管鏡或經(jīng)皮肺活檢取得的樣本量少，有些取樣并不能完全代表整個腫瘤組織，而IHC、RT-PCR兩種檢測方法都需要高質(zhì)量和足夠數(shù)量的樣本，這就可能造成檢測到的ERCC1表達水平與真實情況之間的差異。因此，為最大可能減少由于樣本量過少造成的這種差異，對于不能手術(shù)的晚期NSCLC患者，應(yīng)選擇重復(fù)、多點取樣，以增強樣本的代表性和檢測的準確性。

2.4 原發(fā)病灶和轉(zhuǎn)移病灶ERCC1表達的不同 Gomez等[16]采用IHC方法對49例NSCLC患者原發(fā)病灶和相應(yīng)轉(zhuǎn)移病灶中四種分子標記物表達進行測定，結(jié)果顯示原發(fā)病灶和相應(yīng)轉(zhuǎn)移病灶分子標志物表達存在差異，其中20例患者（41%）原發(fā)病灶和相應(yīng)轉(zhuǎn)移病灶ERCC1表達水平不同。他們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶ERCC1表達水平高于相應(yīng)原發(fā)灶，特別是發(fā)生腦轉(zhuǎn)移和腎上腺轉(zhuǎn)移的NSCLC患者。原發(fā)病灶和轉(zhuǎn)移病灶ERCC1表達水平的不同，可能是生物標志物在腫瘤本身表達的不同或在疾病進展過程中ERCC1基因表達譜發(fā)生了生物學(xué)改變[2]。

NSCLC確診時許多患者出現(xiàn)了轉(zhuǎn)移病灶。有無轉(zhuǎn)移是判斷患者預(yù)后的重要指標，如以單一原發(fā)或轉(zhuǎn)移病灶ERCC1表達水平為標準評價患者預(yù)后，可能導(dǎo)致評價失誤。而對于其中接受含鉑方案治療的患者，僅檢測原發(fā)病灶ERCC1表達可能不足以準確預(yù)測鉑類藥物療效，以此為指導(dǎo)制定晚期NSCLC發(fā)生轉(zhuǎn)移患者的個體化療方案可能無法達到預(yù)期效果。因此，對晚期NSCLC發(fā)生轉(zhuǎn)移性疾病患者測定ERCC1表達病灶的選擇，還需進一步探討。

3 探討其他檢測ERCC1表達的可能途徑

腫瘤組織多點、重復(fù)取樣雖可提高ERCC1表達水平檢測的準確率，但對晚期NSCLC患者造成極大痛苦，其他簡便、快捷的檢測方法有必要進一步研究。血液標本容易獲取，通過檢測循環(huán)腫瘤細胞ERCC1表達水平指導(dǎo)轉(zhuǎn)移NSCLC患者的個體化治療是一種值得考慮的方法。Zhang等[17]利用RT-PCR技術(shù)檢測49例接受吉西他濱和順鉑治療的NSCLC患者外周血和腫瘤組織中核糖核苷酸還原酶M1（ribonucleotide reductase M1, RRM1）、ERCC1 mRNA表達，評價ERCC1表達與臨床和病理因素、治療反應(yīng)、患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個基因表達均與臨床和病理因素?zé)o關(guān)，腫瘤組織ERCC1 mRNA低表達者化療療效和預(yù)后較好（中位OS長），RRM1 mRNA表達在外周血與腫瘤組織中呈正相關(guān)（r=0.332, P=0.020），但兩種組織中ERCC1 mRNA表達無相關(guān)性（r=0.258,P=0.073），不能預(yù)測鉑類化療效果。這提示通過外周血檢測到ERCC1表達可能不能充分反映腫瘤組織ERCC1的表達。

Das等[18]采用一種新的循環(huán)腫瘤細胞檢測技術(shù)評價17例發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移且接受鉑類藥物治療的NSCLC患者循環(huán)腫瘤細胞ERCC1表達與預(yù)后的關(guān)系，他們利用一種使用光纖陣列掃描技術(shù)的高速掃描儀檢測循環(huán)腫瘤細胞中的分子標記物，結(jié)果表明ERCC1低表達患者的PFS長。但由于其研究樣本量較少，這種方法是否可行需要通過進一步研究證實。

4 ERCC1表達結(jié)合其他因素指導(dǎo)NSCLC患者個體化治療

4.1 ERCC1聯(lián)合其他分子標志物檢測制定NSCLC患者個體化治療方案 肺癌是一種多因素疾病，肺癌患者腫瘤細胞中可能出現(xiàn)多種遺傳學(xué)改變。除了通過ERCC1的檢測評價患者預(yù)后和預(yù)測鉑類療效之外，同時對其他有意義的分子標志物進行檢測，可大大提高對NSCLC患者制定“量體裁衣”式個體化治療方案的準確性。Azuma等[19]評價ERCC1和β-微管蛋白III的表達與45例接受卡鉑和紫杉醇方案的NSCLC患者療效的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)ERCC1和β-微管蛋白III表達均陰性者PFS與OS明顯長于其他表達組合的患者?？ㄣK和紫杉醇是臨床治療NSCLC常用的化療藥組合，同時對可能與這兩種藥耐藥有關(guān)的分子標志物進行檢測，可更好的選擇能使用該方案進行化療的患者，使預(yù)期化療效果達到最佳。

4.2 結(jié)合分子因素和臨床因素共同制定NSCLC患者個體化治療方案 目前，強調(diào)基于分子分型個體化治療的同時，我們?nèi)圆荒芎鲆暸R床因素，結(jié)合分子和臨床因素共同制定的個體化治療方案才是對“量體裁衣”最恰當(dāng)?shù)脑忈?。這些臨床因素主要包括患者個人狀況如性別、年齡、職業(yè)、吸煙情況、生活環(huán)境、家庭情況（遺傳因素）、體力狀態(tài)、體重減輕情況、其他與肺癌有關(guān)的呼吸系統(tǒng)疾病史等；以及腫瘤組織狀況包括病理組織學(xué)類型、臨床分期等因素。

Holm等[11]采用IHC法檢測ERCC1表達水平對接受卡鉑和吉西他濱方案治療的不能手術(shù)的NSCLC患者的影響，他們對性別因素進行分層分析，163例入組患者中包括81例男性和82例女性。結(jié)果表明，ERCC1表達水平對患者預(yù)后的影響僅表現(xiàn)在男性，而ERCC1表達陽性或陰性對女性患者生存率影響的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。同時，他們還發(fā)現(xiàn)相比腺癌，鱗癌患者更容易表現(xiàn)出ERCC1陽性。Lee等[20]研究發(fā)現(xiàn)ERCC1高表達與鱗癌組織學(xué)類型具有相關(guān)性。目前，大多數(shù)對ERCC1表達水平與患者預(yù)后或鉑類耐藥的研究中，入組患者大多為男性，實驗未對性別因素進行分層分析，故沒有確切得到性別因素與ERCC1表達水平是否具有一定關(guān)系，而肺癌的組織學(xué)類型是否與ERCC1表達高低有關(guān)，也需進一步研究證實。Wang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，同樣采用順鉑為主的化療方案，I期和II期-IIIa期NSCLC患者ERCC1表達對預(yù)后的作用不同，I期ERCC1高表達者預(yù)后好；而II期-IIIa期ERCC1低表達者預(yù)后好，這表明個體化治療方案中，腫瘤的臨床分期是一個不可忽視的因素。此外，Azuma等[22]研究發(fā)現(xiàn)具有ERCC1陰性表達和體力狀態(tài)較好的接受鉑類藥物化療的NSCLC患者OS長。

5 探索基于ERCC1分子標志物的NSCLC治療新策略

ERCC1表達水平與鉑類耐藥的確切關(guān)系需要進一步研究證實。然而，目前研究多是基于ERCC1表達水平來評價患者的預(yù)后和鉑類藥物療效的預(yù)測作用。如果ERCC1表達水平確實與鉑類療效存在確切的相關(guān)性，那么我們可以通過抑制ERCC1表達水平來增強NSCLC高表達患者對鉑類藥物的敏感性，探索基于ERCC1分子標志物的NSCLC治療新策略。Chang等[23]采用小干擾RNA（small interfering RNA, siRNA）技術(shù)抑制ERCC1表達水平，研究細胞對鉑類藥物的敏感性。結(jié)果表明，使用ERCC1 siRNA特異性抑制ERCC1表達水平可提高人類腫瘤細胞對鉑類藥物的敏感性，將來ERCC1 siRNA技術(shù)可能成為一種新的、高效的治療策略用于鉑類化療方案中。

6 小結(jié)

轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究存在的問題表明，ERCC1能否作為獨立評價NSCLC患者預(yù)后與鉑類藥物療效預(yù)測的分子標志物的問題仍不能得到解答。但ERCC1是具有研究價值的肺癌分子標志物，其在轉(zhuǎn)化階段存在的問題，仍有待解決。在今后的研究設(shè)計過程中，需要著重開展大樣本量的前瞻性隨機對照臨床試驗，對可能的混雜因素進行必要的控制，并且使用統(tǒng)一的評價指標，得出更有助于臨床確定個體化治療方案的結(jié)論，以更好的指導(dǎo)臨床實踐。