新布尼亞病毒流行病學(xué)及檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

張麗萍 王玉春,2 趙 勇,3 馬雪征 甄 維 胡孔新

（1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院 北京 100123；2.河南師范大學(xué)；3.吉林大學(xué)）

1 前言

2010年，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心在對(duì)湖北、山東、江蘇、安徽、遼寧等部分地區(qū)發(fā)生的以發(fā)熱伴血小板減少為主要臨床癥狀的散發(fā)感染性疾病病例研究中發(fā)現(xiàn)一種新型布尼亞病毒，命名為發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Bunyavirus，SFTSV）[1]即為新布尼亞病毒，該病毒引起的疾病稱為發(fā)熱伴血小板減少綜合征（severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS）。對(duì)于這種人類新發(fā)現(xiàn)的新型病毒，對(duì)其形貌、結(jié)構(gòu)、治病機(jī)制和傳播原理等還處于初步研究階段，大部分尚未獲得確切的研究定論。研究表明，該病毒的傳播不僅與蜱叮咬有關(guān)，而且SFTSV 可以通過(guò)血液接觸造成人-人之間的傳播[2,3]。因此，該病毒的早期診斷對(duì)疾病的預(yù)防和控制具有非常重要的意義。

針對(duì)SFTSV的研究綜述，李德新等已經(jīng)從病原學(xué)、流行病學(xué)特征、臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室診斷和治療等方面進(jìn)行了初步介紹[4,5]。本文重點(diǎn)就SFTSV近期的基本特性、國(guó)內(nèi)外流行病學(xué)動(dòng)態(tài)及檢測(cè)方法等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

2 基本特性

2.1 病毒基因組

新布尼亞病毒屬于布尼亞病毒科白蛉病毒屬，有一種有包膜分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒。病毒基因組包括L、M、S 3個(gè)片段，具有布尼亞病毒的一般特征，其基因組兩端末端序列是反向互補(bǔ)的，所以通常由氫鍵作用形成"鍋柄狀"的雙鏈結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)出形態(tài)為環(huán)狀RNA[6]。但是SFTSV的全基因組序列無(wú)論核苷酸和氨基酸與布尼亞病毒科其他病毒相比具有高度差異，與白蛉病毒屬其他病毒相比，S片段相對(duì)保守，但其氨基酸同源性最高僅41%左右，L和M片段氨基酸同源性在21%-36%之間[4]。

2.2 病毒形貌

SFTSV病毒顆粒電子顯微鏡和原子力顯微鏡下呈球形，直徑約為80-100nm，有雙層脂質(zhì)包膜，包膜表面有糖蛋白組成的突起。原子力顯微鏡下可見(jiàn)SFTSV球形顆粒，邊界清晰，形狀規(guī)則，階高約30nm，表面平均粗糙度和表面均方粗糙度值分別約為0.420和0.342［7］。

2.3 臨床癥狀

SFTSV感染潛伏期為7-14 d，起病急。胡建利等［8］對(duì)臨床癥狀進(jìn)行基本的統(tǒng)計(jì)，有發(fā)熱（100%）、乏力（80%）、畏寒（60%）、全身酸痛（45%）、頭痛（40%）等全身中毒癥狀；嘔吐（60%）、惡心（45%）、腹瀉（50%）、腹脹（20%）、嘔血（10%）等消化道癥狀；牙齦出血（25%）、皮膚淤點(diǎn)淤斑（15%）、眼結(jié)膜充血（10%）等出血癥狀；淺表淋巴結(jié)腫大（45%）癥狀；血小板計(jì)數(shù)減少（100%），范圍在（0.2-78×109）/L；白細(xì)胞計(jì)數(shù)減少（90%），范圍在（1.1-11.2×109）/L。大多數(shù)患者很快出現(xiàn)肝、腎等器官功能受損，少數(shù)因病情進(jìn)展快出現(xiàn)意識(shí)障礙、皮膚瘀斑、呼吸道、消化道出血等，可因休克、呼吸衰竭、彌漫性血管內(nèi)凝血( DIC)等多臟器功能衰竭死亡［1,9,10］。

2.4 致病機(jī)制

目前關(guān)于S F T S V的致病機(jī)制已有初步的研究，SFTSV的感染可能激活了神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體（TrkA）、血小板衍生生長(zhǎng)因子受體（PDGFR）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（VEGFR）等受體酪氨酸激酶（RTKs），并通過(guò)宿主細(xì)胞的RTKs-PI3K/Akt-mTOR 信號(hào)傳導(dǎo)通路完成基因組復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、病毒蛋白質(zhì)合成、裝配及子代病毒的釋放等感染后期過(guò)程［11］。對(duì)于SFTSV致病機(jī)制的研究尚處于初級(jí)階段，有待于研究者進(jìn)一步研究獲得全面詳細(xì)的致病機(jī)制信息。

3 流行病學(xué)特征

3.1 國(guó)內(nèi)流行病學(xué)特性

SFTS病例多散發(fā)于丘陵地貌的農(nóng)村地區(qū)，野外作業(yè)人群容易被病毒感染，病例時(shí)間分布具有明顯的季節(jié)性，一般始于3月，高峰期在5-7月，可以延續(xù)至11月份。病毒感染人群年齡分布在39歲至83歲之間，沒(méi)有性別差異。目前認(rèn)為其傳播與蜱叮咬有關(guān)，人類可通過(guò)蜱蟲叮咬而得病。接觸患者血液、分泌物或排泄物可以導(dǎo)致病毒感染［12］。

對(duì)于國(guó)內(nèi)SFTSV的流行病學(xué)特性研究，國(guó)內(nèi)多個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)所在地區(qū)SFTSV進(jìn)行了詳細(xì)的研究，為SFTSV的流行病學(xué)研究提供確切的理論依據(jù)。

傳播媒介方面，胡建利等［8］對(duì)2010年江蘇省確診的20例人感染SFTSV的病例進(jìn)行臨床特點(diǎn)和流行病學(xué)特征的描述分析，發(fā)病前2周內(nèi)均有蜱蟲叮咬史。劉蕓等［13］調(diào)查2009—2011年遼寧省8市發(fā)熱伴血小板減少綜合征新病原， 2011年大連一起“蜱咬”發(fā)熱伴血小板減少病例的血液樣本中分離出SFTSV 毒株，與叮咬的蜱分離出的SFTSV毒株M片段全序列同源性高達(dá)99. 7%［14］，但未檢出可能的自然界中的動(dòng)物宿主鼠類攜帶SFTSV核酸。目前為止蜱蟲還是已知的SFTSV的重要傳播媒介。然而一些臨床病例并沒(méi)有明顯的蜱叮咬史，因此SFTSV的具體傳播途徑尚不完全清楚［15］。

宿主方面，張文帥等［16］對(duì)2010年7-11月在江蘇省南京6個(gè)地區(qū)的來(lái)源于人和動(dòng)物的2853例樣本進(jìn)行研究，檢測(cè)出5種動(dòng)物( 犬、羊、牛、豬、雞)血清樣本SFTSV總抗體陽(yáng)性，陽(yáng)性率分別為6.40%、57. 14%、31. 82%、5. 33%和0. 98%; 人血清中SFTSV 總抗體陽(yáng)性率為0. 94%。說(shuō)明SFTSV屬于人獸共患病，且存在地區(qū)差異。人群與動(dòng)物SFTSV血清總抗體陽(yáng)性率存在正相關(guān)關(guān)系。但尚不能獲得動(dòng)物傳染給人的有力證據(jù)，還需要進(jìn)一步研究。

區(qū)域差異性方面，浙江省首次發(fā)現(xiàn)SFTSV感染病例后，對(duì)患者血清進(jìn)行了病毒分離，并且通過(guò)同源進(jìn)化樹(shù)分析得知所有毒株可以分為兩個(gè)群，浙江省和湖北省分離株同源性最高達(dá)92.2%，江蘇、河南、安徽、山東、遼寧分離株的同源性較高，可達(dá)89.0%，但是兩群基因序列差異較大，可達(dá)53.1%，可見(jiàn)不同群的SFTSV 分布有地域性差異［17］。

回顧性分析發(fā)現(xiàn)，早在1996年江蘇省就有類似發(fā)熱伴血小板較少病例的報(bào)道［18］。說(shuō)明可能不僅江蘇省，我國(guó)其他地區(qū)在2009年以前均有可能存在SFTSV的局部流行只是2009年該病毒被發(fā)現(xiàn)命名以來(lái)才被重視。

3.2 國(guó)外相關(guān)報(bào)道

SFTSV雖然是我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)的病毒，但并非僅在中國(guó)存在。2013年1月，在日本國(guó)內(nèi)首次確診SFTS。至2014年4月份，九州、四國(guó)、近畿等13個(gè)縣有53人感染，其中21人死亡。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，日本北海道、巖手和宮城等23道府縣中檢測(cè)的蜱蟲均有攜帶作為傳染源的病毒。此外，福岡、富山等3個(gè)縣中也在蜱蟲所棲息的山野的鹿等野生動(dòng)物身上發(fā)現(xiàn)了感染病毒后產(chǎn)生的抗體，共計(jì)30個(gè)道府縣確認(rèn)有患者及病毒［19］。此外韓國(guó)感染SFTS病毒的患者共有36人，其中17人死亡［20］。美國(guó)密蘇里州也發(fā)現(xiàn)與SFTSV高度相似的病毒引發(fā)的病例報(bào)告［21］。國(guó)外這些SFTS病原與我國(guó)現(xiàn)有的SFTS病原是否同源需進(jìn)一步考證研究。

4 檢測(cè)技術(shù)

4.1 病毒分離

病毒分離是病毒檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，是不可取代的經(jīng)典方法?？梢灾庇^的觀測(cè)到細(xì)胞病毒，借助儀器更可以觀察到病毒顆粒。病毒的變異非常迅速，病毒分離法可以分離出最新流行的病毒變異株，對(duì)識(shí)別新發(fā)傳染病意義重大。

病毒分離可使用早期SFTSV感染患者急性期的血清標(biāo)本，可采用Vero、Vero E6等細(xì)胞或其他敏感細(xì)胞進(jìn)行盲傳，三代后即10-15d的實(shí)驗(yàn)周期，然后使用 Real-time PCR 病毒核酸診斷方法、ELISA、免疫熒光等方法確定是否分離到該病毒［4］。杜燕華等在SFTS患者急性期血清標(biāo)本中，選核酸檢測(cè)陽(yáng)性、距發(fā)病時(shí)間 1 周內(nèi)、保存質(zhì)量好的164份標(biāo)本，用非洲綠猴腎(Vero)細(xì)胞培養(yǎng)。經(jīng)Vero細(xì)胞培養(yǎng)，僅少量樣品培養(yǎng)物觀察到輕微的細(xì)胞變化，但標(biāo)本經(jīng)3代培養(yǎng)后，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)，陽(yáng)性率40.85%。其中58份Vero細(xì)胞中電鏡下觀察到橢圓形或球形病毒顆粒［22］。

病毒分離技術(shù)在SFTSV檢測(cè)中雖然經(jīng)典，但是往往存在成本較高，培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，生物安全要求高，操作技術(shù)復(fù)雜，不易觀察細(xì)胞病變等缺點(diǎn)。

4.2 病毒形態(tài)學(xué)鑒定

電子顯微鏡和原子力顯微鏡方法檢測(cè)SFTSV，能夠直觀的觀察到SFTSV病毒顆粒形貌［7］，但對(duì)樣本完整性、病毒量及病毒液純度要求較高，其不足在于檢測(cè)結(jié)果取決于顯微鏡操作者的技能和專業(yè)知識(shí)，且顯微鏡方法的設(shè)備昂貴，不利于推廣。

4.3 血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)

4.3.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

將SFTSV NP編碼基因應(yīng)用轉(zhuǎn)載表達(dá)的方法制備NP蛋白，用于包被和標(biāo)記 HRP，建立雙抗原夾心ELISA法，檢測(cè)SFTSV特異性總抗體，靈敏度100%，特異性99.57%［23］。用捕獲ELISA法檢測(cè)患者急性期IgM，用抗原夾ELISA法檢測(cè)患者恢復(fù)期IgG，發(fā)現(xiàn)5例2代病人滴度均在1∶640-1∶5120之間［24］。

4.3.2 免疫熒光染色技術(shù)（IFA）

用免疫熒光反應(yīng)特異、穩(wěn)定性較好的病毒株，接種于Vero 細(xì)胞培養(yǎng)，制成抗原片，以異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記羊抗人IgG抗體為二抗，建立IFA法，與RT-PCR比較，相對(duì)于RT-PCR法，IFA法靈敏度95.60%、特異性74.29% 、符合率89.68%［25］。

4.3.3 免疫膠體金技術(shù)

免疫膠體金技術(shù)(Immune colloidal gold technique)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。劉娟等［26］應(yīng)用血清學(xué)檢測(cè)方法和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測(cè)連續(xù)采集的煙臺(tái)地區(qū)萊州、蓬萊疑似發(fā)熱伴血小板減少綜合征患者血清，用膠體金實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)抗SFTSV IgM抗體，膠體金方法和ELISA方法檢測(cè)結(jié)果總符合率為96.67%。

血清學(xué)檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)在于對(duì)病人血清做初步檢測(cè)，應(yīng)用免疫學(xué)原理檢測(cè)病人血清中相應(yīng)病毒的抗體，進(jìn)行初步診斷，而且結(jié)果可以直接觀察，但該方法的特異性不強(qiáng)。

4.4 核酸檢測(cè)方法

核酸檢測(cè)是SFTS早期檢測(cè)和臨床診斷的重要手段，其突出特點(diǎn)就是檢測(cè)特異性強(qiáng)。SFTSV的核酸檢測(cè)技術(shù)，現(xiàn)階段主要是針對(duì)病毒S、M、L 基因片段的普通RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法。

呂慧榮等應(yīng)用試劑公司和河南省疾病預(yù)防控制中心聯(lián)合研發(fā)的SFTSV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒和同類普通RT-PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行評(píng)價(jià)試驗(yàn)。檢測(cè)對(duì)象為58例發(fā)熱伴血小板減少綜合征病例和100例發(fā)熱待查門診病例。相對(duì)于普通RTPCR方法，實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法的靈敏度為97.36%，特異度為100%，實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法，具有更好的靈敏度和特異性［27］。

虞吉寅等［28］以SFTSV的L基因組為靶基因設(shè)計(jì)引物探針，建立實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法并利用該方法對(duì)舟山市岱山縣臨床疑似患者血液、野鼠內(nèi)臟、分離病毒等標(biāo)本進(jìn)行了SFTSV核酸快速檢測(cè)。宋玉亮等［29］以SFTSV基因組M節(jié)段的保守區(qū)為靶區(qū)域，設(shè)計(jì)特異性引物和Taqman 探針，建立熒光定量RT-PCR。靈敏度為2×102- 2×103copy/mL。遲媛媛等［30］針對(duì)L、M、S基因設(shè)計(jì)引物探針，應(yīng)用巢式PCR方法分別擴(kuò)增22例SFTS確診病例和20例正常人血清中SFTSV RNA的L、M和S片段，對(duì)不同引物擴(kuò)增的靈敏度與特異度并進(jìn)行比較，研究病毒檢出率與血清采集時(shí)間的關(guān)系。獲得結(jié)果S片段靈敏度最高，其次是L片段，未擴(kuò)出M片段。血清中病毒RNA檢出率比較，7 d 與7-14 d檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

任宜等［31］為進(jìn)一步提高熒光定量RT-PCR在SFTSV檢測(cè)中的準(zhǔn)確性。通過(guò)套式RT-PCR擴(kuò)增Ct值處于35 -40之間的血清樣本，采用病毒分離、序列測(cè)定、blast 比對(duì)、同源性比較與聚類分析來(lái)鑒定樣本中的新型布尼亞病毒。結(jié)果4份Ct值處于35-40之間的血清樣本均檢測(cè)到與陽(yáng)性對(duì)照一致的擴(kuò)增條帶?，F(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中經(jīng)常遇到Ct值處于35-40之間的臨床病人血樣無(wú)法及時(shí)報(bào)告，給臨床和流行病學(xué)造成誤診或漏診，任宜等通過(guò)對(duì)4份Ct值處于35-40之間的血清樣本檢測(cè)鑒定，為正確處理Ct值處于35-40之間的臨床血清樣本，提出一種新的檢測(cè)思路，有利于SFTSV檢測(cè)在結(jié)果的準(zhǔn)確性和全面性方面的發(fā)展。

此外還有反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP）快速檢測(cè)SFTSV，該技術(shù)有較高的特異性和敏感性,檢出限為10TCID/50mL，結(jié)合熒光檢測(cè)試劑(羅斯福)方法，結(jié)果在30min內(nèi)通過(guò)觀察顏色變化確定結(jié)果［32］。通過(guò)將反轉(zhuǎn)錄交叉啟動(dòng)擴(kuò)增（reverse transcription cross priming amplification, RT-CPA）和垂直流（vertical flow, VF）偶聯(lián)，快速準(zhǔn)確的檢測(cè)SFTSV。RT-CPA-VF檢測(cè)限為100copies/反應(yīng),檢測(cè)的敏感性和特異性分別為94.1%和100.0%［33］。利用SFTSV的非編碼核苷酸建立 “質(zhì)粒介導(dǎo)的RNA聚合酶I迷你復(fù)制子系統(tǒng)”［34］等。

隨著準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)單和低成本的檢測(cè)方法的不斷問(wèn)世，將有利于SFTSV在我國(guó)的進(jìn)一步檢測(cè)和預(yù)防。

5 防治與展望

研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)蘇拉明對(duì)白蛉病毒屬 RNA的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的阻礙作用，能有效抑制SFTSV病毒復(fù)制，為作用于SFTSV-N及其同源蛋白潛在治療白蛉病毒屬病毒疾病的治療藥物研發(fā)打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[35]。

SFTSV 感染起病急、病情重、病死率高，可以通過(guò)接觸病人血液等傳播，所以早期快速實(shí)驗(yàn)室確診對(duì)于早期診斷、早期隔離、早期治療、早期防控具有重要意義。對(duì)SFTSV的研究建立在生物學(xué)基礎(chǔ)上，筆者已經(jīng)初步了解SFTSV的基因組結(jié)構(gòu)和表達(dá)策略。SFTSV基因組包括3片段，編碼4中結(jié)構(gòu)蛋白，包括兩種外源糖蛋白（Gn、Gc），一種外殼蛋白（N）和一種超大的多聚酶（L），但對(duì)這幾種蛋白的功能還缺乏更深入的了解。我國(guó)不同地區(qū)分離的SFTSV毒株序列存在巨大差異，與國(guó)外毒株之間的差異尚須做進(jìn)一步研究。SFTSV致病機(jī)制僅做了初步的研究，對(duì)于病毒入侵、復(fù)制、引起機(jī)體損傷中的許多問(wèn)題尚不清楚。血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)ELISA 、IFA 、GICA和核酸檢測(cè)技術(shù)PCR、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法以及新的RT-LAMP、RT-CPA-VF等檢測(cè)方法，在SFTSV檢測(cè)中已有初步應(yīng)用，但需要更為準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)單和低成本檢測(cè)方法，為SFTSV的防控打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

SFTSV的研究?jī)H僅是一個(gè)開(kāi)端, 對(duì)它許多問(wèn)題還有待進(jìn)一步的探索和認(rèn)知,，而對(duì)它的防治更是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。

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