白細(xì)胞介素22在玫瑰糠疹患者外周血單一核細(xì)胞及血清中的表達(dá)

孫怡 王振華

白細(xì)胞介素22在玫瑰糠疹患者外周血單一核細(xì)胞及血清中的表達(dá)

孫怡 王振華

目的探討白細(xì)胞介素(IL)-22在玫瑰糠疹發(fā)病機(jī)制中的作用。方法熒光實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR檢測(cè)玫瑰糠疹患者急性期、恢復(fù)期及健康對(duì)照組PBMC中IL-22mRNA的表達(dá)水平。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清中IL-22的水平。結(jié)果玫瑰糠疹患者急性期、恢復(fù)期及健康對(duì)照組PBMC中IL-22 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為4.15±1.36、2.89±0.91和1.91±0.60,急性期明顯高于恢復(fù)期(t=3.61,P＜0.05),恢復(fù)期高于健康對(duì)照組(t=3.84,P＜0.05)。玫瑰糠疹患者急性期、恢復(fù)期及健康對(duì)照組血清中IL-22水平分別為(36.87±10.63)、(21.44±7.33)和(13.22±4.26)ng/L,急性期明顯高于恢復(fù)期(t=5.01,P＜0.05),恢復(fù)期高于健康對(duì)照組(t=4.49,P＜0.05)。血清IL-22水平與玫瑰糠疹病程呈正相關(guān)(r=0.883,P＜0.05)。結(jié)論IL-22在玫瑰糠疹患者外周血及血清中表達(dá)明顯升高,可能在玫瑰糠疹的發(fā)病中起一定作用。

糠疹,玫瑰;白細(xì)胞介素22;發(fā)病機(jī)制

玫瑰糠疹病因及發(fā)病機(jī)制不明,目前學(xué)者多認(rèn)為該病與病毒感染和細(xì)胞免疫平衡失調(diào)有關(guān)。近期的研究發(fā)現(xiàn),玫瑰糠疹患者表皮浸潤(rùn)的細(xì)胞主要為輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞,表皮、真皮乳頭內(nèi)朗格漢斯細(xì)胞明顯增多,表明細(xì)胞免疫反應(yīng)參與了本病的發(fā)生。白細(xì)胞介素(IL)-22屬于IL-10細(xì)胞因子家族,主要由激活的Thl淋巴細(xì)胞、Th17細(xì)胞等產(chǎn)生,主要作用靶細(xì)胞為上皮細(xì)胞。我們檢測(cè)IL-22在玫瑰糠疹急性期及恢復(fù)期患者外周血單一核細(xì)胞及血清中的表達(dá),探討IL-22在玫瑰糠疹發(fā)病中的作用。

一、對(duì)象與方法

(一)臨床資料:收集2011年9月至2012年10月在濰坊市人民醫(yī)院皮膚科門診就診、經(jīng)臨床確診并符合以下條件的患者:①均有典型的臨床表現(xiàn),發(fā)病3～10 d;②受試前臨床檢查未發(fā)現(xiàn)急性感染征象,無(wú)其他免疫相關(guān)性疾病,發(fā)病后未接受系統(tǒng)用藥及外用藥物治療。不合并有肝、腎及其他嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病,非懷孕或哺乳期婦女,無(wú)非婚性接觸史。共收集48例急性期玫瑰糠疹患者,其中男28例,女20例,年齡15～45(30.1±12.5)歲。恢復(fù)期為以上所有患者經(jīng)窄譜中波紫外線(NB-UVB)治療后皮疹消退,病程為14～52(32.85± 19.17)d。健康對(duì)照組為性別、年齡與病例組相匹配的同期健康體檢者20例。

(二)治療方法:給予患者NB-UVB治療,初始照射劑量根據(jù)患者皮膚類型而定,一般為0.4～0.6 J/cm2,每次照射劑量較前次增加0.1 J/cm2,每周治療3次。記錄治療次數(shù),當(dāng)皮損基本消退、療效指數(shù)(即治療前癥狀體征評(píng)分-治療后癥狀體征評(píng)分/治療前癥狀體征評(píng)分)＞90%時(shí)停止照射,治療結(jié)束1周后采集靜脈血。治療次數(shù)為4～14(8.2±4.8)次。

(三)主要試劑和儀器:Ficoll-Hypaque淋巴細(xì)胞分離液、RPMI 1640培養(yǎng)液產(chǎn)自美國(guó)Invitrogen公司;RNAiso Plus、一步法反轉(zhuǎn)錄RT試劑盒、實(shí)時(shí)PCR試劑盒均產(chǎn)自日本TaKaRa公司;IL-22 ELISA檢測(cè)試劑盒產(chǎn)自美國(guó)RD公司;熒光定量PCR儀(Icycler IQ Multicolor實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng))為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。

(四)實(shí)驗(yàn)方法:

1.血清和PBMC的分離:無(wú)菌條件下分別采集玫瑰糠疹患者急性期、恢復(fù)期和健康對(duì)照組外周乙二胺四乙酸抗凝血5 ml,室溫1 500 r/min(離心半徑15 cm)10 min,提取血清,分裝入凍存管中。用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法獲得PBMC,將PBMC裝于1.5 ml微量離心管。標(biāo)本均置于-70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.PBMC中IL-22基因的檢測(cè):①提取RNA:按RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取PBMC總RNA,紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA含量;②RNA反轉(zhuǎn)錄:cDNA合成按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書操作;③實(shí)時(shí)定量PCR:使用定量PCR反應(yīng)儀,引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,管家基因β肌動(dòng)蛋白引物序列:上游為5′-CAAGCCTCCCAGTCCAAGAT-3′,下游為5′-ATTGCTGATGTCATAAGGGC-3′;IL-22 mRNA引物序列:上游為5′-CCAGGCTCAGCAACAGGCTAA-3′,下游為5′-TTTCAGCTCTGGTCAAATG-3′。采用25 μl反應(yīng)體系,其中SYBR Green實(shí)時(shí)PCR Master Mix 12.5 μl,下游引物(10 μmol/L)各1 μl,模板溶液2.5 μl,反應(yīng)條件為95℃60 s變性,然后95℃15 s,60℃15 s,72℃45 s,40個(gè)循環(huán)。收集熒光信號(hào),得到每個(gè)標(biāo)本不同指標(biāo)的Ct值,以β肌動(dòng)蛋白mRNA的量為內(nèi)參照,根據(jù)公式2-△△Ct計(jì)算所測(cè)指標(biāo)的相對(duì)表達(dá)量。

3.血清IL-22水平的測(cè)定:應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清IL-22水平,具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度所對(duì)應(yīng)的濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度。

(五)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSSl6.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn)。采用Pearson進(jìn)行相關(guān)性分析;檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

二、結(jié)果

1.PBMC中IL-22 mRNA的表達(dá):急性期、恢復(fù)期玫瑰糠疹患者及健康對(duì)照組PBMC中IL-22 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為4.15±1.36、2.89±0.91和1.91±0.60;急性期玫瑰糠疹患者外周血PBMC中IL-22 mRNA的表達(dá)明顯高于恢復(fù)期(t=3.61,P＜0.05),恢復(fù)期高于健康對(duì)照組(t=3.84,P＜0.05)。

2.血清中IL-22的表達(dá)水平:急性期、恢復(fù)期玫瑰糠疹患者和健康對(duì)照組血清中IL-22水平分別為(36.87± 10.63)、(21.44±7.33)和(13.22±4.26)ng/L。急性期玫瑰糠疹患者血清中IL-22水平明顯高于恢復(fù)期(t=5.01,P＜0.05),恢復(fù)期IL-22水平高于健康對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.49,P＜0.05)。

3.相關(guān)性分析:急性期玫瑰糠疹患者血清IL-22的水平(36.87±10.63)ng/L與玫瑰糠疹病程(32.85±19.17)d呈正相關(guān)(r=0.883,P＜0.05),與治療次數(shù)呈正相關(guān)(r=0.751,P＜0.05)。

三、討論

玫瑰糠疹發(fā)病原因仍未明確,但群集發(fā)病、很少?gòu)?fù)發(fā)、臨床表現(xiàn)為發(fā)疹性皮疹及自限性病程等特點(diǎn)支持其發(fā)病與感染有關(guān)。已經(jīng)有很多研究表明玫瑰糠疹發(fā)病與多種病毒感染[包括人類皰疹病毒(HHV)-6、HHV-7及甲型H1N1流感病毒等]有關(guān)[1-3]。還有研究[4]顯示,T細(xì)胞在玫瑰糠疹的發(fā)生發(fā)展中起主要介導(dǎo)作用,與抗原提呈細(xì)胞密切相互作用,釋放各種細(xì)胞因子,引起特異性免疫反應(yīng)。

玫瑰糠疹和銀屑病有很多相似之處,都是T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥性皮膚病,且玫瑰糠疹也出現(xiàn)表皮角化不全、輕度棘層肥厚及真皮炎癥。因此,與銀屑病發(fā)病密切相關(guān)的IL-22同樣也可能參與玫瑰糠疹的發(fā)病。Gangemi等[5]檢測(cè)病情處于早期的16例玫瑰糠疹血清中IL-22水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),患者血清中IL-22水平顯著高于對(duì)照,但該研究病例數(shù)較少且僅對(duì)玫瑰糠疹早期患者的血清進(jìn)行檢測(cè)。本文研究結(jié)果顯示,急性期玫瑰糠疹患者外周血PBMC中IL-22 mRNA表達(dá)水平明顯高于恢復(fù)期及健康對(duì)照組,恢復(fù)期亦明顯高于健康對(duì)照組。玫瑰糠疹急性期血清IL-22明顯高于恢復(fù)期及健康對(duì)照者。提示玫瑰糠疹患者中IL-22高表達(dá),而作為分泌IL-22主要來(lái)源的Th17細(xì)胞可能參與玫瑰糠疹的發(fā)病。

[1]Wolk K，Witte E，Wallace E，et al.IL-22 regulates the expression of genes responsible for antimicrobial defense，cellular differentiation，and mobility in keratinocytes:a potential role in psoriasis[J].Eur J Immunol，2006，36(5):1309-1323.

[2]Boniface K，Bernard FX，Garcia M，et al.IL-22 inhibits epidermal differentiation and induces proinflammatory gene expression and migration of human keratinocytes[J].J Immunol，2005，174(6): 3695-3702.

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2013-10-31)

(本文編輯:尚淑賢)

Expressions of interleukin-22 in sera and peripheral blood mononuclear cells of patients with pityriasis rosea

Sun Yi，Wang Zhenhua.Department of Dermatology，Weifang People′s Hospital，Weifang 261041，Shandong，China

Wang Zhenhua，Email:wfzcwzh@126.com

ObjectiveTo investigate the role of interleukin-22(IL-22)in the pathogenesis of pityriasis rosea(PR).MethodsPeripheral venous blood samples were obtained from 48 patients with PR in acute stage and recovery stage and from 20 healthy human controls.Real-time fluorescence-based quantitative PCR was performed to measure the mRNA expression of IL-22 in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)，and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)to determine the level of IL-22 in sera.ResultsThe relative expression level of IL-22 mRNA in the patients with PR in recovery stage was significantly higher than that in the healthy controls(2.89± 0.91 vs.1.91±0.60，t=3.84，P＜0.05)，but lower than that in the patients in acute stage(2.89±0.91 vs.4.15± 1.36，t=3.61，P＜0.05).Similarly，the level of serum IL-22 was significantly increased in the patients with PR in recovery stage compared with the healthy controls((21.44±7.33)vs.(13.22±4.26)ng/L，t=4.49，P＜0.05)，and increased in the patients with PR in acute stage compared with those in recovery stage((36.87±10.63)vs. (21.44±7.33)ng/L，t=5.01，P＜0.05).The level of serum IL-22 was positively correlated with the stage of PR (r=0.883，P＜0.05).ConclusionsIL-22 is overexpressed in PBMCs and sera of patients with PR，implying that IL-22 is involved in the pathogenesis of PR.

Pityriasis rosea;Interleukin-22;Pathogenesis

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.10.022

261041山東,濰坊市人民醫(yī)院皮膚科

王振華,Email:wfzcwzh@126.com