生物發(fā)光技術(shù)在細(xì)菌生物被膜感染中的應(yīng)用

劉旭,李悅,蔡蕓△,王瑾,王睿

(1.解放軍總醫(yī)院 臨床藥理研究室,北京 100853;2.解放軍總醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心,北京 100853)

生物發(fā)光技術(shù)在細(xì)菌生物被膜感染中的應(yīng)用

劉旭1,李悅2,蔡蕓2△,王瑾2,王睿2

(1.解放軍總醫(yī)院 臨床藥理研究室,北京 100853;2.解放軍總醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心,北京 100853)

細(xì)菌生物被膜感染難以根除，應(yīng)用傳統(tǒng)方法研究動(dòng)物生物被膜感染需耗費(fèi)大量動(dòng)物且不能動(dòng)態(tài)監(jiān)測動(dòng)物體內(nèi)生物被膜發(fā)展情況，生物發(fā)光技術(shù)解決了這一難點(diǎn)。近年來，生物發(fā)光技術(shù)逐漸應(yīng)用于細(xì)菌生物被膜感染研究中，展現(xiàn)了良好的發(fā)展前景。本文對細(xì)菌生物發(fā)光技術(shù)的機(jī)制、特點(diǎn)及近年來生物發(fā)光技術(shù)在生物被膜感染模型、抗菌藥物有效性方面、指征移植材料上生物被膜易感性的應(yīng)用做一綜述。

生物發(fā)光技術(shù)；細(xì)菌生物被膜感染；感染模型；抗菌藥有效性；移植材料易感性

細(xì)菌生物被膜(bacterial biofilm,BF)是指細(xì)菌粘附于物體或人體組織表面,通過分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂質(zhì)蛋白等,將其自身包繞其中而形成的大量高度組織化、系統(tǒng)化的膜樣聚合物［1］。因其特殊結(jié)構(gòu),BF可以對抗免疫系統(tǒng)和抗菌藥物作用,使得感染根除十分困難［2］。生物發(fā)光技術(shù)具有非放射性、高靈敏度、非侵入性等優(yōu)點(diǎn),且能實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測BF在體內(nèi)的發(fā)展情況［3-4］。本文通過查閱相關(guān)研究文獻(xiàn),對細(xì)菌生物發(fā)光機(jī)制、生物技術(shù)在BF感染的發(fā)展及應(yīng)用作一綜述,以期為研究者應(yīng)用生物發(fā)光技術(shù)診斷、治療BF感染提供參考。

1 細(xì)菌生物發(fā)光機(jī)制

生物發(fā)光成像檢測的光是由特定底物和熒光素酶作用所產(chǎn)生的,建立BF發(fā)光有2種方法:第一種是從細(xì)菌,如發(fā)光冷桿菌等,獲取lux操縱子來編碼合成熒光素酶和熒光素底物,可將lux操縱子轉(zhuǎn)移到其他種類的細(xì)菌上來進(jìn)行成像研究,細(xì)菌lux操縱子的表達(dá)特點(diǎn)是不需要外源性底物就能發(fā)光［5］。Rochetta等［5］曾通過導(dǎo)入luxCDABE的大腸桿菌來研究生物發(fā)光技術(shù)用來確定體內(nèi)外抗菌藥物的療效;Daniel C等［6］也曾將克隆lux操縱子的鮑曼不動(dòng)桿菌感染小鼠,通過生物發(fā)光技術(shù)來檢測感染范圍。

第二種是從有機(jī)體,如北美螢火蟲等一些發(fā)光生物的熒光素酶基因標(biāo)記細(xì)胞或細(xì)胞染色體DNA,通過單克隆篩選技術(shù),將熒光素酶的基因插入到預(yù)期觀察細(xì)菌的染色體內(nèi),使熒光素酶基因得以持續(xù)穩(wěn)定表達(dá),外源性給予底物熒光素后,熒光素和熒光素酶發(fā)生反應(yīng),生成氧化熒光素釋放光子并發(fā)光［4］。早在1985年,Dewet JR等［7］克隆了P.Pyralis的熒光素酶基因,并使其在大腸桿菌中表達(dá)。

2 生物發(fā)光技術(shù)在BF感染應(yīng)用中的發(fā)展

1995年,Contag等［8］首次證明了應(yīng)用生物發(fā)光成像技術(shù)監(jiān)測小鼠體內(nèi)細(xì)菌感染的可行性;2005年,Jun Y等［9］建立了小鼠體內(nèi)金黃色葡萄球菌BF感染模型,應(yīng)用生物發(fā)光技術(shù)成功的監(jiān)測了對利福平耐藥的金黃色葡萄球菌突變株在體內(nèi)生長的適應(yīng)性,為研究耐藥菌株提供了參考;同年,Cla'udia等［10］使用Sorbarod持續(xù)灌注系統(tǒng)培養(yǎng)銅綠假單胞菌PAO1生物被膜,用環(huán)丙沙星灌注生物被膜3 h后待其恢復(fù)到未加藥前的水平時(shí)再開始第二次給藥灌注,用生物發(fā)光技術(shù)來追蹤環(huán)丙沙星對抗銅綠假單胞菌BF感染的效果,這一研究表明生物發(fā)光技術(shù)可以用來評(píng)估抗菌藥物對抗 BF感染的有效性;2010年,Bernthal NM等［11］將金黃色葡萄球菌接種到膝關(guān)節(jié)并植入到小鼠體內(nèi),用生物發(fā)光成像技術(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)測BF,結(jié)果發(fā)現(xiàn):表面涂有米諾環(huán)素和利福平的移植膝關(guān)節(jié)上BF的形成大大降低,這一模型不僅可以用于評(píng)估體內(nèi)治療BF感染,同時(shí)也為關(guān)節(jié)成形術(shù)后感染的預(yù)防提供了方法;2013年,Garcez AS等［12］將牙根管灌注銅綠假單胞菌,3 d后待其形成BF后,將其植入10顆人類牙齒中,用生物發(fā)光技術(shù)連續(xù)監(jiān)測和評(píng)估細(xì)菌活性,這一實(shí)驗(yàn)為治療牙根管生物被膜感染提供了研究模型;2014年,Vande Velde G等［13］在動(dòng)物皮下植入感染了白色念珠菌的導(dǎo)尿管,應(yīng)用生物發(fā)光技術(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)測體內(nèi)白色念珠菌BF的形成,包括從酵母到菌絲的形態(tài)變化,這一研究使得人們對與酵母菌感染類似的BF感染的致病機(jī)制有了進(jìn)一步了解。

3 應(yīng)用

BF是細(xì)菌相對于浮游狀態(tài)的一種群體生存形式,存在于BF中的菌體較其浮游狀態(tài)對抗菌藥物表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗藥性［14］。為了評(píng)估細(xì)菌活性、監(jiān)測BF的形成,治療BF感染,研究者們不斷做出各種嘗試。傳統(tǒng)的研究方法是用細(xì)菌經(jīng)口、腹腔等途徑感染動(dòng)物后,間隔不同時(shí)間段將動(dòng)物處死,解剖后檢測各種器官的病理變化［15］,從而對BF的生長情況等作出評(píng)估。然而這一方法的不足之處在于它不能避免異質(zhì)性、且不能實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測BF的狀況。近年來,生物發(fā)光技術(shù)正不斷被人們應(yīng)用于BF的研究中,它具有高靈敏度、無放射性等特點(diǎn),特別是可以在同一只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物活體上實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)非創(chuàng)傷實(shí)時(shí)監(jiān)測,大大節(jié)省了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成本,獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)避免了個(gè)體差異,更加直觀可靠,展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景［4］。

3.1 應(yīng)用生物發(fā)光技術(shù)建立BF感染模型 目前,應(yīng)用生物發(fā)光技術(shù)研究BF感染還處于初步研究階段,主要為動(dòng)物研究,研究者通過建立感染模型來了解BF的形成及發(fā)展。Pribaz JR等［16］建立了小鼠體內(nèi)金黃色釀膿葡萄球菌BF感染模型,應(yīng)用生物發(fā)光技術(shù)研究關(guān)節(jié)成形術(shù)后金黃色釀膿葡萄球菌BF感染,證實(shí)生物發(fā)光技術(shù)可長期用于監(jiān)測金黃色釀膿葡萄球菌附著和BF形成。Daghighi S等［17］應(yīng)用生物發(fā)光技術(shù)比較可降解和不可降解的移植生物材料上BF的生長情況。體外研究中分別在可降解和不可降解的生物材料上培養(yǎng)金黃色葡萄球菌Xen29 BF,通過獲取的光量子數(shù)代替細(xì)菌數(shù)量,結(jié)果顯示可降解材料上的光量子數(shù)更少。之后建立體內(nèi)模型,將感染有金黃色葡萄球菌Xen29的生物材料植入小鼠皮下,用生物發(fā)光技術(shù)來監(jiān)測BF情況,并進(jìn)行微生物學(xué)和組織學(xué)評(píng)價(jià),結(jié)果顯示小鼠體內(nèi)移植的可降解生物材料光量子數(shù)少于不可降解材料,且植入可降解生物材料的小鼠組織中炎癥細(xì)胞數(shù)量明顯少于不可降解材料。Garcez AS等［18］通過建立牙根管BF感染模型比較光動(dòng)力學(xué)療法(PDT)、標(biāo)準(zhǔn)的牙髓治療和聯(lián)合這2種方法治療牙根管BF感染的效果。從人體提取10顆牙齒,灌注奇異變形細(xì)菌和銅綠假單胞菌來形成牙根管BF,應(yīng)用生物發(fā)光技術(shù)對BF發(fā)展實(shí)時(shí)監(jiān)測及定量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨(dú)應(yīng)用常規(guī)牙髓治療方法使細(xì)菌生物發(fā)光減少90%,單獨(dú)應(yīng)用PDT減少95%,聯(lián)合應(yīng)用減少98%,且治療后觀察24 h發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用比各自單獨(dú)應(yīng)用的細(xì)菌再生大大減少。

3.2 生物發(fā)光技術(shù)在抗菌藥物有效性方面的研究 抗菌藥物問世后,細(xì)菌感染在很長一段時(shí)間內(nèi)受到了有效控制。但隨著插管,植入假體等大量使用,BF感染日益嚴(yán)重,在臨床上甚至面臨無藥可用的境地。生物發(fā)光技術(shù)可實(shí)時(shí)監(jiān)測應(yīng)用抗菌藥物后,BF的發(fā)展情況,可幫助人們更加直觀了解抗菌藥物對BF的作用,以便更好地治療BF感染。例如:Xiong YQ等［19］以金黃色葡萄球菌BF感染兔子心臟為研究模型(這里選用的金黃色葡萄球菌是對萬古霉素和頭孢唑啉敏感但對慶大霉素耐藥的),然后分別應(yīng)用萬古霉素、頭孢唑啉和慶大霉素進(jìn)行治療,用生物發(fā)光技術(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)測用藥前后兔子心肌的發(fā)光信號(hào),研究發(fā)現(xiàn):給予萬古霉素治療3 d后心肌上的發(fā)光信號(hào)減少,然而停藥3 d后發(fā)光信號(hào)卻大大增加;頭孢唑啉使心肌上發(fā)光信號(hào)適度減少;慶大霉素不引起發(fā)光信號(hào)減少,表明生物發(fā)光技術(shù)能快速地觀察和定量抗菌藥的治療效果;Niska JA等［20］將耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)和對甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(MSSA)植入小鼠膝關(guān)節(jié),分別靜脈注射萬古霉素、達(dá)托霉素、替吉環(huán)素,通過生物發(fā)光技術(shù)顯示的細(xì)菌數(shù)和BF的形成情況來比較這3種抗菌藥物對MRSA和MSSA的預(yù)防能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)達(dá)托霉素和替吉環(huán)素外科植入感染MRSA和MSSA的預(yù)防劑量范圍比萬古霉素更廣;Andreu N等［21］為了評(píng)估異煙肼對抗結(jié)核分枝桿菌的有效性做了如下實(shí)驗(yàn):用攜帶有螢火蟲熒光素酶基因的M.肺結(jié)核菌株感染小鼠,用生物發(fā)光成像技術(shù)監(jiān)測動(dòng)物在應(yīng)用抗結(jié)核病藥異煙肼前后疾病的發(fā)展變化,觀察到:小鼠應(yīng)用異煙肼治療后生物發(fā)光明顯減少,這一實(shí)驗(yàn)再次表明生物發(fā)光技術(shù)可以作為評(píng)估抗菌藥物有效性的工具。

3.3 指征移植材料上的BF易感性 生物材料相關(guān)感染是現(xiàn)代外科手術(shù)中頻繁出現(xiàn)的一個(gè)問題,也是導(dǎo)致生物材料移植失敗的最主要原因,據(jù)統(tǒng)計(jì),每年有超過150 000感染與外科植入感染有關(guān),移植材料上一旦形成BF,就要進(jìn)行外科手術(shù)將其移除,不僅增加了醫(yī)療費(fèi)用也延長了患者的住院時(shí)間［11,20,22-23］。為了解決這一問題,人們應(yīng)用生物發(fā)光技術(shù)來征移植材料上的BF易感性。為了選擇不易形成BF感染的人造血管移植材料,Lorenz U等［24］以小鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?分別向35只小鼠皮下移植感染了能生物發(fā)光的金黃色葡萄球菌的人造血管,比較聚四氟乙烯、聚酯、牛的心包膜和表面涂有銀的裝置上分別形成金黃色葡萄球菌BF的易感性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)涂有銀的裝置上活菌數(shù)最少,說明此移植材料有一定的抵抗細(xì)菌的能力,比較聚四氟乙烯和聚酯上的細(xì)菌密度,發(fā)現(xiàn)聚四氟乙烯的優(yōu)勢并不顯著。Chauhan A等［25］將已形成BF的完全植入式靜脈輸液管(TIVAP)植入成熟大鼠體內(nèi),研究TIVAP污染的臨床相關(guān)病原體,大腸桿菌,銅綠假單胞菌,金黃色葡萄球菌及表皮葡萄球菌 BF感染,證明TIVAP這一封閉設(shè)備比起其他靜脈插管可降低BF感染的風(fēng)險(xiǎn)。

4 結(jié)論

生物發(fā)光技術(shù)以其靈敏度高、非放射性、可進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測、結(jié)果直觀可靠等優(yōu)點(diǎn),正逐漸應(yīng)用于BF感染研究中。但生物發(fā)光技術(shù)研究BF感染也有一些限制,如成熟的BF內(nèi)部為缺氧狀態(tài),且細(xì)菌活力不高,而細(xì)菌生物發(fā)光需要氧氣等條件［26］,可能造成細(xì)菌數(shù)量與其光亮強(qiáng)度的不對等。且由于生物發(fā)光穿透力,易被組織吸收,易受信號(hào)干擾、定位準(zhǔn)確性等因素的限制,所以目前只應(yīng)用于與實(shí)驗(yàn)性小動(dòng)物相關(guān)的生命科學(xué)研究領(lǐng)域,真正進(jìn)入人類臨床研究尚有距離［4］。但相信隨著生物發(fā)光技術(shù)的不斷發(fā)展,生物發(fā)光技術(shù)會(huì)成為研究BF感染的有力工具。

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(編校:吳茜)

App lications of biolum inescence in biofilm infection

LIU Xu1,LIYue2,CAIYun2△,WANG Jin2,WANG Rui2

(1.Department of Clinical Pharmacology,PLA General Hospital,Beijing 100853,China;2.traditional Chinese Medicine,PLA General Hospital,Beijing 100853,China.)

Bacterial biofilm infection is difficult to eradicate,traditionalmethods studied animal biofilm infections spend a number of animals and it cannotmonitor the development of the biofilm,but bioluminescence technology has solved this difficulty.In recent years,bioluminescence technology has applied in the study of bacterial biofilm infection,shows good prospects.This paper reviews the bacterial bioluminescence technology'smechanism,characteristics,applications in biofilm infection model,antimicrobial effectiveness and indications on the graftmaterial biofilm susceptibility.

bioluminescent technology;bacterialbiofilm infections;infectionmodel;antibacterialeffectiveness;transplantmaterial susceptibility

R969

A

1005-1678（2014)06-0184-03

國家科技部十二五重大專項(xiàng)滾動(dòng)課題(2012ZX09303004-002)；北京市自然科學(xué)基金(7122167)

劉旭，女，藥師，研究方向：抗菌藥物的合理應(yīng)用 E-mail：liuxu199061@sina.com；蔡蕓，通信作者，女，副研究員，研究方向：臨床藥理學(xué)與抗菌藥物的合理應(yīng)用，E-mail：caicaihh@yahoo.com.cn。