貼壁細(xì)胞電阻抗譜等效電路模型的建立與分析*

焦 泉，胥善治，楊生勝，秦曉剛，王 鵬*

(1.清華大學(xué)精密儀器系，北京100084;2.蘭州空間技術(shù)物理研究所真空低溫技術(shù)與物理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730000)

0 引言

細(xì)胞貼附是細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、細(xì)胞間連接形成、代謝、分裂、分化和凋亡等組織或腫瘤形成過(guò)程的初始步驟?；谏锓椒ǖ臋z測(cè)，如采用標(biāo)記，都是基于終點(diǎn)的檢測(cè)，并且會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定影響。細(xì)胞電生理研究采用電學(xué)方法研究細(xì)胞的生理狀態(tài)的改變，其中很重要的一種方法是細(xì)胞電阻抗傳感，它在藥物篩選和臨床診斷方面有很大作用。

細(xì)胞電阻抗傳感檢測(cè)(electriccell-substrate impedance sensing，ECIS)最早是由Giaever 和Keese 兩個(gè)人［1］在1984年提出，細(xì)胞在金電極上貼附生長(zhǎng)會(huì)改變電極溶液的整體阻抗，他們使用細(xì)胞電阻抗來(lái)監(jiān)測(cè)細(xì)胞在金電極上的繁殖和形態(tài)變化，這種方法的特點(diǎn)是實(shí)時(shí)、非侵入式和無(wú)標(biāo)記性。Giaever 和Keese 所使用的測(cè)量電極形式是一個(gè)小面積(3 ×10-4cm2)的工作電極與一個(gè)大面積(2 cm2)的參比電極，測(cè)量4 kHz 頻率下阻抗隨時(shí)間的變化，并建立相應(yīng)的分析模型［2-3］。采用小面積測(cè)量電極進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，由于電極面積很小，細(xì)胞不容易分布均勻，且每次測(cè)量位置不同會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生很大影響，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較差。而后在1997年Ehert［4］首次全面報(bào)道了叉指電極(IDE)檢測(cè)細(xì)胞行為的研究，相比于小面積的單點(diǎn)電極，叉指電極的覆蓋面積大，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，多用于細(xì)胞毒理的研究。在細(xì)胞阻抗的研究中，大多使用單頻點(diǎn)下的阻抗隨時(shí)間的變化來(lái)反應(yīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)變化，其中就涉及到頻率點(diǎn)的選取問(wèn)題，頻率點(diǎn)的選取，最開(kāi)始Giaever 對(duì)于頻率點(diǎn)的選擇原因沒(méi)有做出說(shuō)明，不同頻率點(diǎn)的選擇對(duì)于結(jié)果會(huì)有影響，其后的研究中，所采用的頻率點(diǎn)選擇方法通常是先測(cè)量一個(gè)寬頻率(通常1 Hz～1 MHz)下的無(wú)細(xì)胞溶液電阻抗譜與有細(xì)胞溶液電阻抗譜，選取細(xì)胞有無(wú)狀態(tài)下阻抗幅值差值最大所在的頻率點(diǎn)，測(cè)量該頻率點(diǎn)下細(xì)胞阻抗值隨時(shí)間的變化來(lái)評(píng)定細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)［5］。這種方法簡(jiǎn)化了測(cè)量過(guò)程，對(duì)于藥物檢測(cè)也有實(shí)際的作用。

在本研究開(kāi)展的工作中，筆者所采用的電極形式是叉指電極，實(shí)驗(yàn)所測(cè)量數(shù)據(jù)是細(xì)胞溶液的電阻抗譜，由此建立細(xì)胞溶液的等效電路模型，分析模型參數(shù)隨時(shí)間的變化情況，給出細(xì)胞貼附生長(zhǎng)生理變化與等效模型參數(shù)變化之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，相對(duì)于單頻點(diǎn)的測(cè)量，本研究所使用的方法能夠給出關(guān)于細(xì)胞貼附生長(zhǎng)更加全面的生理信息。

1 理論分析

使用電極測(cè)量細(xì)胞阻抗時(shí)，首先需分析無(wú)細(xì)胞存在時(shí)電極與溶液之間的阻抗。按照電化學(xué)理論的解釋?zhuān)芤弘娀瘜W(xué)反應(yīng)包含兩個(gè)過(guò)程，一個(gè)是離子從溶液擴(kuò)散在電極界面，這是傳質(zhì)過(guò)程;然后離子在電極上發(fā)生反應(yīng)，這是活化過(guò)程。整個(gè)電化學(xué)反應(yīng)模型可以用經(jīng)典Randles 電路表示，該等效電路模型如圖1所示。

圖1 Randles 等效電路模型

Rp和W 一起成為法拉第阻抗，包含的是電化學(xué)反應(yīng)過(guò)程的阻抗。該電路中，Rs和Cdl近似于是理想的電路元件，而Rp和W 阻抗并非是理想的元件，它們與測(cè)試頻率之間還有一定的關(guān)系。

上述基礎(chǔ)等效電路分析的是典型的電化學(xué)反應(yīng)過(guò)程，該過(guò)程中電極與溶液會(huì)發(fā)生氧化還原反應(yīng)，而在生物實(shí)驗(yàn)中，由于使用的金電極是惰性電極，電極上基本上不發(fā)生氧化還原反應(yīng)，即法拉第阻抗很大。

McAdams［6］等人的研究表明，等效電路可以簡(jiǎn)化為如圖2所示的等效電路模型。

圖2 簡(jiǎn)化后電極溶液界面等效電路模型

根據(jù)圖2 的等效模型可知，即電極溶液界面的阻抗等效為一個(gè)常相角元件CPE，它的阻抗表達(dá)式為:

式中:K—與溶液特性相關(guān)的參數(shù)，包括溶液濃度、溶液體積等因素;β—與電極屬性相關(guān)的參數(shù)，包括電極的材料、電極表面粗糙度等。

生物細(xì)胞由細(xì)胞膜包裹細(xì)胞液組成，細(xì)胞液含有離子，導(dǎo)電性較好，而細(xì)胞膜是磷脂雙分子結(jié)構(gòu)，磷脂雙分子層導(dǎo)電性很差，上面分布著各種類(lèi)型的通道，水分子與離子只能通過(guò)相應(yīng)的特殊通道進(jìn)出細(xì)胞，這導(dǎo)致細(xì)胞膜的導(dǎo)電性很差。而由于水化作用的存在會(huì)使得細(xì)胞膜表面形成雙電層，整體細(xì)胞帶有一定量的靜電荷，最終使得細(xì)胞整體容抗很大、電導(dǎo)很小［7］。文獻(xiàn)［7］表明細(xì)胞整體電容率達(dá)到0.5 μF/cm～1.3 μF/cm，電導(dǎo)率達(dá)到102Ω·cm2～105Ω·cm2。子宮頸癌Hela 細(xì)胞具有貼壁特性，它在培養(yǎng)液中需先貼附到培養(yǎng)器皿的底部器壁上，而后才能進(jìn)行正常生長(zhǎng)繁殖。細(xì)胞接入培養(yǎng)皿初始時(shí)分，細(xì)胞懸浮于溶液中，整體呈球狀，然后開(kāi)始貼附過(guò)程，細(xì)胞與容器底部發(fā)生物理接觸，整體舒展，貼附完成后，細(xì)胞整體呈梭形附著在容器底部，此時(shí)細(xì)胞膜與電極之間的間距達(dá)到10 nm～20 nm。按照此前的研究結(jié)果，細(xì)胞對(duì)電極的貼附會(huì)改變電極流出電流的通路，Giaever 和Keese建立了一個(gè)基于電流流向分布的數(shù)學(xué)解析模型，該模型參數(shù)能夠?qū)崟r(shí)表征細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的變化。

其后，Wengener［8］利用等效電路對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，Cho［9］將CPE 模型用于表征細(xì)胞膜阻抗，胡朝穎等［10］提出的等效分析電路如圖3所示。對(duì)比經(jīng)典Randles 等效電路模型，圖3(a)所示模型增加了細(xì)胞電極間隙的阻抗以及細(xì)胞本身的阻抗;圖3(b)所示模型將間隙阻抗與細(xì)胞阻抗統(tǒng)一簡(jiǎn)化成為一個(gè)整體，用于表征由于細(xì)胞存在對(duì)模型整體帶來(lái)的影響。

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圖3 細(xì)胞貼附前后等效電路圖

綜合上述分析，得到的細(xì)胞貼附等效電路模型如圖4所示。

圖4 細(xì)胞貼附叉指電極等效電路

2 材料與方法

2.1 細(xì)胞阻抗測(cè)量裝置的研制

細(xì)胞阻抗測(cè)量裝置主要感應(yīng)部分是叉指金電極，電極的外觀結(jié)構(gòu)圖如圖5所示。其中，電極整體外觀如圖5(a)所示。圖5(a)中，一塊電極上面有4 個(gè)感應(yīng)電極，組成四通道傳感器。單通道電極的形狀和主要結(jié)構(gòu)參數(shù)如圖5(b)所示。主要的參數(shù)有兩個(gè)，分別是叉指電極的寬度D 和電極間距W，實(shí)驗(yàn)所用的電極芯片參數(shù)為:D=20 μm，W=100 μm。電極采用微電子加工技術(shù)獲得，在硅玻璃基底上加工出20 μm 厚度的鈦和200 μm 厚度的金，鈦的存在是為了增大金和硅玻璃之間的附著。

圖5 叉指電極外觀結(jié)構(gòu)

為了實(shí)時(shí)培養(yǎng)細(xì)胞和施加電信號(hào)，需要增加培養(yǎng)結(jié)構(gòu)和電路連接結(jié)構(gòu)，制備完整的細(xì)胞培養(yǎng)腔。細(xì)胞培養(yǎng)整體結(jié)構(gòu)構(gòu)成如圖6所示。

圖6 細(xì)胞培養(yǎng)整體結(jié)構(gòu)

2.2 細(xì)胞阻抗譜測(cè)試系統(tǒng)

細(xì)胞阻抗譜測(cè)試系統(tǒng)構(gòu)成圖如圖7所示。細(xì)胞測(cè)量裝置整體置于培養(yǎng)箱中，來(lái)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)地培養(yǎng)和測(cè)量。傳感器芯片通過(guò)杜邦線與電化學(xué)工作站(Parstat 4000)相連，在計(jì)算機(jī)界面上對(duì)Parstat 4000 進(jìn)行控制，使得Parstat 4000 施加幅值為20 mV，頻率為1 Hz～1 MHz 的交流電壓給測(cè)量裝置，響應(yīng)信號(hào)被Parstat 4000 采集后，經(jīng)過(guò)處理，最后得到阻抗譜數(shù)據(jù)。

圖7 細(xì)胞阻抗譜測(cè)試系統(tǒng)

2.3 Hela 細(xì)胞培養(yǎng)與測(cè)量

實(shí)驗(yàn)所采用的的細(xì)胞是Hela 細(xì)胞，將Hela 細(xì)胞接種于含有10% 的胎牛血清的DMEM(dulbecco's modified eagle's medium)溶液中。整體測(cè)量裝置置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)10 h，每隔一小時(shí)測(cè)量一次阻抗譜。在放入培養(yǎng)箱1 h 時(shí)與10 h 時(shí)這兩個(gè)時(shí)刻對(duì)細(xì)胞進(jìn)行顯微拍照。

3 結(jié)果與討論

3.1 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)

本研究選取Hela 細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料。因Hela 細(xì)胞對(duì)表面要求不高，無(wú)需做表面處理即可良好貼附生長(zhǎng)，接種細(xì)胞1 h 時(shí)與接種10 h 時(shí)顯微鏡下觀察到的細(xì)胞形態(tài)如圖8所示。由圖8 可知，接入細(xì)胞1 h 時(shí)，細(xì)胞多懸浮在電極表面，呈圓形顆粒狀;而在接入細(xì)胞10 h時(shí)，細(xì)胞已經(jīng)在電極表面貼附，并且伸展開(kāi)呈單層生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞呈梭形狀態(tài)。從細(xì)胞分布來(lái)看，電極區(qū)域與非電極區(qū)域并無(wú)明顯分布差異。

圖8 Hela 細(xì)胞加入芯片后顯微鏡下觀察到的細(xì)胞形態(tài)

3.2 模型參數(shù)分析

本研究測(cè)量0 h～10 h 的阻抗譜，每隔1 h 測(cè)量一次，總共得到11 組數(shù)據(jù)。筆者使用圖4所示等效電路對(duì)第一組數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性最小二乘擬合，在高頻區(qū)段，實(shí)際測(cè)量相角出現(xiàn)負(fù)值，而圖4 等效電路不會(huì)出現(xiàn)該種狀況。

圖9 修正后的細(xì)胞溶液阻抗譜等效電路圖

針對(duì)修正前后的等效電路模型，本研究對(duì)0 h 時(shí)的阻抗譜數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，兩次擬合結(jié)果的比較情況如表1所示。對(duì)比結(jié)果可知，修正模型的擬合結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)差遠(yuǎn)小于原模型，擬合效果更優(yōu)，即選用修正模型能夠更好地?cái)M合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

表1 初始模型與修正模型擬合結(jié)果參數(shù)對(duì)比

本研究使用修正模型對(duì)測(cè)量的11 組數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到不同時(shí)刻的7 個(gè)模型參數(shù)，以10 h 時(shí)的參數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)，將0 h～10 h 的模型參數(shù)與之相除，得到標(biāo)準(zhǔn)化的模型參數(shù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)化模型參數(shù)與時(shí)間的關(guān)系，如圖10所示。

圖10 阻抗譜等效電路模型標(biāo)準(zhǔn)化參數(shù)的變化

整體上將參數(shù)分為兩組:第一組參數(shù)反映電極和溶液的固有性質(zhì)，包含L、Rs、K、β;第二組參數(shù)反映細(xì)胞帶來(lái)的影響，包含R1、K1和β1。

第一組參數(shù)中，參數(shù)變化分成兩種。參數(shù)L 開(kāi)始變化很大，可能是由于培養(yǎng)溫度變化引起，其后7 h 保持平穩(wěn)，最后2 h 上升可能是線路抖動(dòng)產(chǎn)生。另外3個(gè)參數(shù)Rs，K，β 全過(guò)程變化不超過(guò)5%，這3 個(gè)參數(shù)反映的是溶液電極固有性質(zhì)，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，電極本身沒(méi)有變化，細(xì)胞生長(zhǎng)消耗了培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而細(xì)胞內(nèi)外離子濃度保持平衡，培養(yǎng)液的電特性不變，所以這幾個(gè)參數(shù)變化不大。

第二組參數(shù)R1、K1，β1變化明顯。如圖10所示，3個(gè)參數(shù)隨時(shí)間是一個(gè)線性變化過(guò)程，因此可以用3 個(gè)參數(shù)的變化來(lái)反應(yīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)貼附狀況。細(xì)胞本身相當(dāng)于一個(gè)容性元件，溶液相當(dāng)于阻性元件，故R1反應(yīng)的是細(xì)胞與電極之間溶液的變化，電流流向與電極表面平行，由于貼附，導(dǎo)致間隙溶液的橫截面減小，電阻增大。細(xì)胞貼附過(guò)程，細(xì)胞本身形狀變扁，類(lèi)比于平板電容，電容值與面積成正比，與電極間距成反比，由于細(xì)胞變扁，細(xì)胞附著在電極上的膜與未附著的膜之間距離變小，而面積變大，最終K1值增大，β1減小。

4 結(jié)束語(yǔ)

本研究組裝出了能實(shí)時(shí)、連續(xù)獲得細(xì)胞電阻抗譜的測(cè)量裝置。

實(shí)際HeLa 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞阻抗測(cè)量裝置能夠?qū)?xì)胞貼附進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，為細(xì)胞電生理如細(xì)胞活性檢測(cè)盒藥物篩選等提供了一種無(wú)損、快速的方案。同時(shí)，針對(duì)實(shí)驗(yàn)中獲得的阻抗譜數(shù)據(jù)，筆者使用等效電路對(duì)其分析，提出修正等效電路模型，用于分析細(xì)胞貼附過(guò)程生理改變。相較于單頻點(diǎn)阻抗變化，該方法提供了更全面的細(xì)胞生理信息。

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