納豆芽孢桿菌和好食性脈胞霉混合固態(tài)發(fā)酵玉米黃粉飼料

■王 燕 文奇男 陳偉康 劉曉蘭 劉 驥 張永根 郭建華

（1.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.遼寧省農(nóng)牧業(yè)機械研究所有限公司，遼寧沈陽 110036；3.東北農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，黑龍江哈爾濱，150030）

我國飼料工業(yè)中蛋白飼料短缺現(xiàn)象比較嚴重，因此需要廣泛開發(fā)新的蛋白質資源，利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)高蛋白飼料是解決目前飼料蛋白質資源匱乏的有效途徑。我國玉米年產(chǎn)量達1.2×108t，約占世界總產(chǎn)量的22%，因此玉米加工淀粉的副產(chǎn)物玉米黃粉含量豐富，且玉米黃粉蛋白含量可達到60%以上，氨基酸總量高于豆粕和魚粉，且代謝能高于玉米。但是其蛋白主要是以醇溶蛋白為主，占蛋白總量的68%，水溶性差，不易被吸收，適口性差，且氨基酸不平衡，因此限制了玉米黃粉的有效利用。

酶法和微生物發(fā)酵法都可以有效酶解玉米黃粉，但是酶法水解肽味苦，微生物發(fā)酵可以改善玉米黃粉風味，且成本較低，因此利用微生物固態(tài)發(fā)酵玉米黃粉是提高玉米附加值的必然趨勢。與液態(tài)發(fā)酵相比，固態(tài)發(fā)酵設備構造簡單、投資少、能耗低、便于推廣。龐錚采用好食性脈孢霉發(fā)酵玉米黃粉制作發(fā)酵飼料，顯著提高可溶性蛋白含量，并飼喂鵪鶉，降低了飼料成本。李秀梅通過誘變篩選出產(chǎn)蛋白酶高的納豆芽孢桿菌發(fā)酵玉米黃粉，以鵪鶉為試驗動物，得出在全價配合飼料中添加45%的納豆桿菌濃醪發(fā)酵玉米黃粉可以提高鵪鶉的生長性能，降低飼料成本。閆亞婷等采用納豆芽孢桿菌發(fā)酵玉米黃粉顯著提高蛋白質溶解度和可溶性糖含量，從而改善玉米黃粉的飼用品質。鄭喜群等通過對納豆桿菌發(fā)酵玉米黃粉產(chǎn)生抗氧化活性肽的研究，確定了納豆桿菌發(fā)酵玉米黃粉的適宜工藝條件，使玉米黃粉的可溶性蛋白質含量達到23.67 mg/ml。

許多研究表明，微生物發(fā)酵飼料對菌種依賴性較大，因此需要選育優(yōu)質菌株。菌株的選擇要從菌株特性（分類、來源、純度、發(fā)酵特性）、安全性資料（毒理、藥理）、健康效應及研究結果等方面綜合考慮。由于微生物酶系互補，因此復合菌種發(fā)酵效果優(yōu)于單菌種發(fā)酵。好食性脈孢霉是本實驗室自主研發(fā)的一類對底物和環(huán)境要求較低，且能利用多種碳源的高產(chǎn)蛋白酶的安全菌株，目前已申請發(fā)明專利。王曉杰等用好食性脈孢霉對玉米酒糟進行固態(tài)發(fā)酵，料液比1∶1.2，接菌量1×106個孢子/g干基，初始pH值7.5，溫度為30℃，發(fā)酵96 h，測定發(fā)酵浸提液蛋白溶出率為36.30%，比發(fā)酵前提高28.96%，粗纖維含量減少30.32%。

納豆芽孢桿菌，具有較強的抗菌活性，但是卻能與其他益生菌搭配使用以提高發(fā)酵飼料性能。將納豆芽孢桿菌與3株乳酸菌混菌發(fā)酵進行體外厭氧培養(yǎng)研究，結果表明納豆芽孢桿菌通過產(chǎn)生過氧化氫酶和枯草蛋白酶促進乳酸桿菌的生長和活性。牛麗亞等研究發(fā)現(xiàn)，納豆芽孢桿菌和啤酒酵母混菌發(fā)酵麥麩、玉米黃粉和豆粕的混合物比單菌株發(fā)酵產(chǎn)物穩(wěn)定。

本課題以玉米黃粉為主要原料，麩皮為輔助原料，以好食性脈孢霉和納豆芽孢桿菌為菌株，采用單因素法對發(fā)酵玉米黃粉的條件進行優(yōu)化，最大限度地提高玉米黃粉的蛋白溶解性，提高玉米黃粉的附加值，為緩解資源短缺和提高原料利用率做貢獻。

1 材料和方法

1.1 試驗菌種

納豆芽孢桿菌和好食性脈孢霉由齊齊哈爾大學生物工程實驗室提供。

1.2 培養(yǎng)基

納豆菌液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖2%，K2HPO40.1%，MgSO40.05%，5%(v/v)的土豆汁(20%比例配制)，pH值7.0。

脈孢霉液體種子培養(yǎng)基：K2HPO40.05%，10%(v/v)的土豆汁(20%比例配制)，pH值6.4。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米黃粉∶麩皮=8∶2，料水比=1∶1.6，pH值自然。

1.3 試驗方法

1.3.1 納豆桿菌種子生長曲線的確定

本試驗在溫度為37℃、裝液量為50 ml（250 ml錐形瓶）、搖瓶轉速為200 r/min的條件下培養(yǎng)，每4 h取一次樣，在560 nm波長下測定吸光度，再根據(jù)菌體濃度標準曲線算出菌體濃度。以時間為橫坐標，菌體濃度為縱坐標，作圖。

1.3.2 脈孢霉種子生長曲線的確定

在玉米漿10%（v/v）,K2HPO40.05%(w/w),搖床轉速180 r/min，錐形瓶裝樣量60 ml/250 ml,接菌量6.0×106個/ml，30℃，初始pH值6.4的條件下培養(yǎng)。每4 h取樣一次，用重量法測出它的菌體濃度。以培養(yǎng)時間為橫坐標，菌體濃度為縱坐標，繪制種子培養(yǎng)基中菌體的生長曲線。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

以8 g玉米黃粉＋2 g麩皮為發(fā)酵底物，料水比=1∶1.6，菌體混合比（w/w，納豆菌∶脈孢霉）=5∶5，兩種菌同時接到發(fā)酵底物上，接種量0.23%（w/w），30℃，pH值自然，培養(yǎng)時間40 h。以上述條件為基礎，采用單因素試驗優(yōu)化料水比、菌體混合比、接菌先后順序及間隔、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間。

2 結果與分析

2.1 納豆桿菌生長曲線的確定（見圖1）

圖1 納豆菌的生長曲線

由圖1可知，在0～8 h，納豆芽孢桿菌處于適應期，從第8 h開始，納豆菌開始快速生長，直到20 h，納豆菌開始進入穩(wěn)定期。對數(shù)期的菌體生長迅速，對環(huán)境適應力強，適合接種。對數(shù)期后期也符合這個條件，而且有較高的菌體濃度，能縮短在發(fā)酵培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時間。綜上所述，納豆桿菌的適宜種齡為19 h，此時菌體濃度為3.96 mg/ml。

2.2 好食性脈孢霉生長曲線（見圖2）

圖2 好食脈孢霉的生長曲線

由圖2可以很明顯看出，在0～8 h脈孢霉處于生長適應期，主要是菌體吸水膨脹，子囊消失的過程。從第8 h開始，菌體生長迅速，進入生長對數(shù)期，一直到20 h。20～24 h菌體生長依然比較快，可能由于菌體濃度過高，營養(yǎng)物質變少，菌體之間的競爭性抑制開始變得顯著，菌體濃度增長趨于平緩。從24 h開始，菌體濃度幾乎沒有變化，進入了生長穩(wěn)定期。綜上所述，因此選擇20 h為脈孢霉最佳種子培養(yǎng)時間，此時菌體濃度為3.65 mg/ml。

2.3 混菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)時間的優(yōu)化

在微生物發(fā)酵過程中，產(chǎn)物濃度會有所變化，培養(yǎng)到一定時間會使產(chǎn)率達到最大，繼續(xù)培養(yǎng)，產(chǎn)率則會減小。因此要獲得發(fā)酵產(chǎn)物，需根據(jù)不同菌種和不同底物來確定最佳發(fā)酵時間。以8 g玉米黃粉加2 g麩皮為發(fā)酵底物，料水比=1∶1.6，菌體混合比（w/w,納豆菌∶脈孢霉）=5∶5，兩種菌同時接到發(fā)酵底物上，接種量0.23%（w/w），30℃，pH值自然，培養(yǎng)時間分別為0、12、22、32、40、46、58、70、82 h。充分拍打發(fā)酵錐形瓶，使發(fā)酵培養(yǎng)基松散，再往發(fā)酵錐形瓶中分別加50 ml生理鹽水，浸提4 h，然后測定可溶性蛋白含量，并計算出蛋白增加量（選擇用可溶性蛋白增加量來衡量培養(yǎng)條件的好壞，可忽略底物不同而引起的培養(yǎng)基蛋白含量不一致的問題）。試驗結果如圖3。

從圖3可知，0～12 h，可溶性蛋白增加緩慢，12～40 h，可溶性蛋白增加量比較大，當培養(yǎng)40 h時，可溶蛋白為9.9 mg/ml。到了40 h以后，由于營養(yǎng)物質消耗比較多，40～58 h可溶性蛋白增加量降低。但58～70 h時，發(fā)酵浸提液中可溶性蛋白增加量又增多，并在70 h時達到最大，為10.4 mg/ml，這可能是由于菌體出現(xiàn)了二次生長的原因，再次利用了發(fā)酵底物中的氮源，合成新的蛋白質。培養(yǎng)基在35 h后，開始依稀有納豆的味道，70 h時，有大量乳白菌絲生成，培養(yǎng)基有異香。

圖3 培養(yǎng)時間對可溶性蛋白增加量的影響

由于培養(yǎng)40 h和70 h可溶性蛋白含量增加量差別不大，考慮到工業(yè)上需要控制生產(chǎn)成本和提高設備利用率，選擇培養(yǎng)時間為40 h。

2.3.2 發(fā)酵底物中麩皮與玉米黃粉添加比例優(yōu)化

培養(yǎng)基是微生物發(fā)酵的基礎，它為微生物提供生長繁殖所必需的營養(yǎng)物質。玉米黃粉營養(yǎng)豐富，但成粉末狀，加水易結塊，不利于空氣流動和菌體發(fā)酵。麩皮價格低廉，添加它能降低成本，并且能使發(fā)酵培養(yǎng)更松散，透氣性更好，需要研究它的添加比例。

在250 ml錐形瓶中裝入麩皮和玉米黃粉共10 g，麩皮∶玉米黃粉分別為1∶9，2∶8，3∶7，4∶6，5∶5，料水比=1∶1.6，菌體混合比（w/w，納豆菌∶脈孢霉）=5∶5，兩種菌同時接到底物上，接種量0.23%（w/w），30℃，pH值自然，培養(yǎng)時間40 h。振蕩發(fā)酵錐形瓶，使發(fā)酵培養(yǎng)基松散，再往錐形瓶中分別加50 ml生理鹽水，浸提4 h，然后測定可溶性蛋白含量，并計算出蛋白增加量。試驗結果如圖4所示。

圖4 不同比例輔料添加對可溶性蛋白增加量的影響

麩皮的蛋白含量比玉米黃粉蛋白少很多，因此可被菌體利用的營養(yǎng)物質少，大量添加降低發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分，所以它只能作為輔料少量添加。從圖4可知，當麩皮∶玉米黃粉為3∶7或者更高時，可溶性蛋白增加較少。當麩皮∶玉米黃粉為2∶8時，可溶性蛋白增加量最多。此時的培養(yǎng)基營養(yǎng)物質比較豐富，而且透氣性好，適合作為發(fā)酵底物配方。當玉米黃粉∶麩皮為9∶1時，加水后易結塊，透氣性不好，因而影響菌體發(fā)酵。

2.3.3 菌體混合比例的優(yōu)化

納豆芽孢桿菌繁殖速度要比好食性脈孢霉快，好食性脈孢霉的芽孢個體要比納豆芽孢桿菌個體大，因此最適培養(yǎng)條件有一定差別。要讓它們在相同的培養(yǎng)條件下，更好更快的利用底物來發(fā)酵，需要一個適宜的菌體混合比。

菌體混合比（w/w，納豆菌∶脈孢霉）分別為1∶9，3∶7，5∶5，7∶3，9∶1，2 g麩皮+8 g玉米黃粉，料水比=1∶1.6，兩種菌同時接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量0.23%（w/w），30 ℃，pH值自然，培養(yǎng)時間40 h。振蕩發(fā)酵錐形瓶，使發(fā)酵培養(yǎng)基松散，再往錐形瓶中分別加50 ml生理鹽水，浸提4 h，然后測定可溶性蛋白含量，并計算出蛋白增加量。試驗結果如圖5所示。

圖5 菌體混合比例對可溶性蛋白增加量的影響

培養(yǎng)基中的微生物協(xié)同互生發(fā)酵，菌體繁殖較快，代謝旺盛，又能分泌不同的蛋白酶類，能充分利用發(fā)酵底物中的氮源來合成蛋白。由圖5可知，在納豆芽孢桿菌和好食性脈孢霉比例為3∶7和5∶5的情況下，可溶性蛋白增加量較多。當納豆菌∶脈孢霉（w/w）為3∶7時，增加的最多，是最適宜的比例。

2.3.4 接種量的優(yōu)化

發(fā)酵時，綜合產(chǎn)物的得率和生產(chǎn)成本，會有一個適宜的接種量。本試驗是混菌發(fā)酵，還要考慮到菌株之間的競爭性，更有必要對其適宜接菌量進行確定。

試驗選擇接菌量分別為：0.15%(w/w)，0.23%(w/w)、0.31%(w/w)、0.39%(w/w)、0.47%(w/w)，兩種菌同時接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，菌體混合比（w/w,納豆菌∶脈孢霉）為3∶7，2 g麩皮+8 g玉米黃粉，料水比=1∶1.6，30℃，pH值自然，培養(yǎng)時間40 h。振蕩發(fā)酵錐形瓶，使發(fā)酵培養(yǎng)基松散，不粘瓶，再往錐形瓶中分別加50 ml生理鹽水，浸提4 h，然后測定可溶性蛋白含量，并計算出蛋白增加量。試驗結果如圖6所示。

圖6 接菌量對可溶性蛋白增加量的影響

從圖6可知，隨著接菌量的增加，可溶性蛋白含量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。不難看出，接菌量大，可溶性蛋白含量增加的多，但當接菌量過大時，會使菌體稠密，營養(yǎng)物質和氧氣供應不足，不利于發(fā)酵。另外，從控制生產(chǎn)成本的角度考慮，也應選擇接菌量為0.31%(w/w)。

2.3.5 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化

一切生化反應都與溫度有關，它是影響微生物發(fā)酵的重要因素之一。由于蛋白質、核酸等機體組成物質對溫度敏感，因此溫度對菌體生長、產(chǎn)物合成都有很大影響，甚至能決定微生物生物發(fā)酵的方向。因此，需確定一個適宜溫度，使發(fā)酵按設想方向進行。

納豆芽孢桿菌的適宜生長溫度為28℃，好食性脈孢霉適宜生長溫度為37℃。本試驗選擇的發(fā)酵溫度分別為25、28、30、32、34 ℃，菌體混合比（w/w,納豆菌∶脈孢霉）為3∶7，兩種菌同時接到培養(yǎng)基中，接菌量為0.31%（w/w），2 g麩皮+8 g玉米黃粉，料水比=1∶1.6，pH值自然，培養(yǎng)時間40 h。充分振蕩發(fā)酵錐形瓶，使發(fā)酵培養(yǎng)基松散，不成塊，再往錐形瓶中分別加50 ml生理鹽水，浸提4 h，然后測定可溶性蛋白含量，并計算出蛋白增加量。試驗結果如圖7所示。

圖7 發(fā)酵溫度對可溶性蛋白增加量的影響

由圖7可知，當溫度為30～34℃時，發(fā)酵效果比較好，培養(yǎng)基中的可溶性蛋白增加量比較多。但此時的溫度不是納豆芽孢桿菌和好食性脈孢霉各自的最佳生長溫度，說明在此溫度下，兩種微生物盡管個體生長未達到最好，但此溫度適合混菌生產(chǎn)可溶性蛋白。而32℃可溶性蛋白增加量最多，為最適培養(yǎng)溫度。

2.3.6 料水比的優(yōu)化

固態(tài)發(fā)酵最大的特點就是培養(yǎng)基含游離態(tài)水少甚至不含游離態(tài)水，因此無廢水排放，且易保存，發(fā)酵產(chǎn)品能直接飼喂。水對菌體生產(chǎn)和產(chǎn)物合成都有較大影響，當培養(yǎng)基中含水量多會使氧氣含量減少，從而影響發(fā)酵，如果含水量過少則無法滿足菌體的代謝需要，抑制產(chǎn)物合成。因此需要根據(jù)不同的菌株和底物來確定一個合適的料水比。

本試驗選擇的料水比分別是1∶1.2、1∶1.6、1∶2.0、1∶2.4、1∶2.8，發(fā)酵溫度為32 ℃，菌體混合比（w/w,納豆菌∶脈孢霉）為3∶7，兩種菌同時接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接菌量為0.31%（w/w），2 g麩皮+8 g玉米黃粉，pH值自然，培養(yǎng)時間40 h。充分振蕩發(fā)酵錐形瓶，使發(fā)酵培養(yǎng)基松散，不成塊，再往錐形瓶中分別加50 ml生理鹽水，浸提4 h，然后測定可溶性蛋白含量，并計算出蛋白增加量。試驗結果如圖8所示。

圖8 料水比對可溶性蛋白增加量的影響

在試驗開始前，料水比1∶1.6，1∶2.0物料和水混合比較好，1∶1.2較松散，但是1∶2.4，1∶2.8較緊密。由圖8可知，當料水比為1∶2.0時，可溶性蛋白增加最多，而且發(fā)酵培養(yǎng)基比較松散，結塊現(xiàn)象不明顯。

2.3.7 接菌順序及間隔時間的優(yōu)化

兩種菌混合發(fā)酵時，總會有一個相對優(yōu)勢和一個相對弱勢的菌株，它們對發(fā)酵培養(yǎng)基的適應時間和發(fā)酵時間都會有些差別。對本試驗來說，霉菌的菌體生長比納豆菌慢，發(fā)酵所需時間也較納豆菌長，因此需要對接菌順序和間隔時間進行優(yōu)化。

本試驗接菌先后和間隔時間分別為：A：先往培養(yǎng)基中加脈孢霉，24 h后再接入納豆菌；B：先加脈孢霉，12 h后再加納豆菌；C：納豆菌和脈孢霉同時接入；D：先加納豆菌，12 h后再加脈孢霉；E：先加納豆菌，24 h后再加脈孢霉。菌株混合后再繼續(xù)培養(yǎng)40 h，其他條件分別為，菌體混合比（w/w，納豆菌∶脈孢霉）為3∶7，2 g麩皮+8 g玉米黃粉，料水比=1∶2.0，接種量0.31%（w/w），32℃，pH值自然。培養(yǎng)完成后，振蕩發(fā)酵錐形瓶，使發(fā)酵培養(yǎng)基松散，再往錐形瓶中分別加50 ml生理鹽水，浸提4 h，然后測定可溶性蛋白含量，并計算出蛋白增加量。試驗結果如圖9所示。

圖9 接菌順序及時間間隔對可溶性蛋白增加量的影響

由圖9可知，先接入脈孢霉接再入納豆菌，然后繼續(xù)培養(yǎng)的效果要強于先加納豆菌或者兩種微生物同時添加。脈孢霉的培養(yǎng)時間長，先接脈孢霉能讓菌體先快速生長，到一定數(shù)量時，再接入納豆菌，此時它們協(xié)同發(fā)酵，甚至互相利用對方所合成營養(yǎng)物質，可溶性蛋白含量增加明顯。A脈孢霉總共培養(yǎng)了64 h，納豆菌培養(yǎng)了40 h，B脈孢霉培養(yǎng)了52 h，納豆菌培養(yǎng)了40 h，這兩種情況下可溶性蛋白增加接近，為了提高設備利用率選擇B較合適（從設備利用率考慮，C最佳，工業(yè)上可以考慮用C條件），可溶性蛋白增加11.8 mg/ml。

3 結論

混菌發(fā)酵玉米黃粉的發(fā)酵條件：發(fā)酵培養(yǎng)基組成為麩皮∶玉米黃粉=2∶8，料水比=1∶2,接菌順序及時間為：先接脈孢霉，12 h后再接納豆菌，接種量為0.31%(w/w)，培養(yǎng)溫度為32℃，pH值自然，培養(yǎng)40 h，可溶性蛋白增加11.8 mg/ml。

（參考文獻12篇，刊略，需者可函索）