食管鱗癌組織中GRIM-19的表達(dá)及意義

陳 鐸，張牧霞

(河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，河北 石家莊050051)

食管癌是最常見的惡性腫瘤之一，我國是食管癌的高發(fā)國家之一，且我國食管癌組織學(xué)類型90%以上為鱗癌［1］。食管癌被公認(rèn)為一種基因性疾病，有多種癌基因和抑癌基因參與了食管癌細(xì)胞的增殖及凋亡等。干擾素/維甲酸聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因- 19 (gene associated with retinoid-interferon-induced mortality-19，GRIM-19)是GRIMs 家族重要成員，其在多種正常組織中表達(dá)，參與干擾素和維甲酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［2］。研究［3］表明，GRIM-19 在多種腫瘤組織中表達(dá)抑制、表達(dá)異常或突變。有關(guān)GRIM-19 蛋白在食管鱗癌組織中表達(dá)的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用免疫組化技術(shù)檢測食管鱗癌、癌旁不典型增生及正常食管黏膜組織中GRIM-19 蛋白表達(dá)，運(yùn)用TUNEL方法檢測食管鱗癌組織中的細(xì)胞凋亡，探討GRIM-19蛋白的異常表達(dá)與食管鱗癌發(fā)生及細(xì)胞凋亡的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 組織標(biāo)本來源 68 例食管鱗癌、35 例癌旁不典型增生及68 例正常食管黏膜組織來自安陽市腫瘤醫(yī)院2008年3月至2010年3月手術(shù)切除標(biāo)本。其中男44 例，女24 例，年齡35 ～75 歲，中位年齡54 歲。浸潤黏膜下層或淺肌層者9 例，浸潤深肌層或外膜層者59 例;伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者20 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者48例;術(shù)前均未接受放、化療。所有標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)為食管鱗癌(經(jīng)HE 染色證實(shí)，癌旁組織中35 例存在不典型增生)，正常食管黏膜組織取自遠(yuǎn)端手術(shù)切緣并經(jīng)病理證實(shí)。

1.1.2 主要試劑 鼠抗人多克隆GRIM-19 蛋白抗體購自美國Abcam 公司;ZYMED S-P 免疫組化染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;TUNEL 試劑盒購自德國Roche 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組化主要步驟 免疫組化采用S-P 法，操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。用已知陽性的乳腺癌組織切片作為陽性對照，以PBS 液代替一抗作為陰性對照。

1.2.2 免疫組化結(jié)果判定 GRIM-19 蛋白陽性表達(dá)信號主要定位在細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒。參照Formowitz 等［4］的綜合計(jì)分法進(jìn)行結(jié)果評定，以確定蛋白陽性表達(dá)。具體方法:高倍鏡視野下計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比評分。陽性細(xì)胞所占比例＜5%記為0 分，5% ～25%為1 分，26% ～50%為2 分，51% ～75%為3 分，＞75%為4分。染色強(qiáng)度評分，樣本無染色為0 分;呈現(xiàn)淡黃色顆粒，明顯高于背景為1 分;出現(xiàn)淺棕黃色顆粒為2 分;出現(xiàn)大量深棕黃色顆粒為3 分。將樣本兩者得分相加為總分。根據(jù)分?jǐn)?shù)把樣本界定為4 類:0 ～1 分為陰性(-)，2 ～3 分為弱陽性(+ )，4 ～5 分為中陽性(++)，6 ～7 分為強(qiáng)陽性(+++)。

1.2.3 TUNEL 方法主要步驟 將組織標(biāo)本進(jìn)行脫蠟和水化;蛋白酶K(pH 7.4 ～7.8)室溫孵育20 min;滴加TUNEL 反應(yīng)混合液后37 ℃下在暗濕盒中反應(yīng)1 h;熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞(激發(fā)光波長為450 ～500 nm，檢測波長為515 ～565 nm);滴加50 ～100 μL DAB工作液，室溫下反應(yīng)10 min，至出現(xiàn)棕色背景為止;蘇木精復(fù)染3 min;光學(xué)顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞(共計(jì)200～500 個(gè)細(xì)胞)并拍照。

1.2.4 TUNEL 方法對照組設(shè)計(jì) 陽性對照:以已知TUNEL 陽性切片做陽性對照。陰性對照:制備TUNEL反應(yīng)混合液時(shí)，不加酶濃縮液。

1.2.5 TUNEL 檢測結(jié)果判定 顯微鏡下觀察到的凋亡細(xì)胞核固縮呈圓形或橢圓形，染色呈現(xiàn)棕褐色，陰性細(xì)胞核無著色。在鏡下計(jì)數(shù)200 個(gè)細(xì)胞，觀察呈現(xiàn)凋亡陽性的細(xì)胞數(shù)，每組選取5 個(gè)分布均勻的視野，取平均值，計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/200)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用χ2檢驗(yàn)來進(jìn)行樣本率的比較，相關(guān)關(guān)系分析用Spearman 相關(guān)性分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中GRIM-19 蛋白的表達(dá) GRIM-19 蛋白陽性表達(dá)信號主要定位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒，陽性對照有陽性信號顯示，陰性對照無陽性信號顯示。GRIM-19 蛋白在正常食管黏膜組織、癌旁不典型增生組織及食管鱗癌組織中的陽性表達(dá)率分別為80.9%(55/68)、34.3%(12/35)和11.8%(8/68)，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 均＜0.05)。

2.2 GRIM-19 蛋白表達(dá)與腫瘤細(xì)胞凋亡的關(guān)系 食管鱗癌凋亡細(xì)胞核固縮呈圓形或橢圓形，染色呈現(xiàn)棕褐色，陰性細(xì)胞核無著色。食管鱗癌組織中腫瘤細(xì)胞的凋亡與GRIM-19 蛋白表達(dá)有關(guān)，GRIM-19 蛋白陽性表達(dá)組中腫瘤細(xì)胞AI 為(5.06 ±0.93)%，顯著高于陰性表達(dá)組的(1.12 ±0.06)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

GRIM-19 是Kalvakolanu 采用反義RNA 敲除技術(shù)在乳腺癌細(xì)胞中篩選鑒定并首先報(bào)道的凋亡蛋白［5］，GRIM-19 是GRIMs 家族重要成員，編碼含144 個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，相對分子質(zhì)量約16 000，定位于19p13.1。GRIM-19 是一種保守基因，在多種正常組織中表達(dá)，參與干擾素和維甲酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［2］。GRIM-19 蛋白的異常表達(dá)激活細(xì)胞的凋亡過程，但僅僅GRIM-19 蛋白的異常表達(dá)并不足以引起細(xì)胞凋亡，GRIM-19 蛋白的異常表達(dá)可以增加細(xì)胞對干擾素和維甲酸誘導(dǎo)的凋亡的敏感性，同時(shí)，GRIM-19 蛋白是一種小的核蛋白，可能協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)凋亡激活蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，GRIM-19 蛋白的羧基端對其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是必不可少的，其表達(dá)降低或位點(diǎn)突變可以導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化［6］。研究［3］表明GRIM-19 在多種腫瘤組織中表達(dá)抑制、表達(dá)異常或突變。

GRIM-19 在正常細(xì)胞中的表達(dá)可以維持細(xì)胞正常的生活周期，促使衰老細(xì)胞凋亡，其基因突變、缺失或表達(dá)下調(diào)均可引起細(xì)胞發(fā)生異常增殖。目前GRIM-19對細(xì)胞增殖和凋亡的影響日益受到重視，但文獻(xiàn)［7-12］報(bào)道多集中在GRIM-19 異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系方面。有關(guān)GRIM-19 異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞凋亡關(guān)系的研究相對較少，GRIM-19 異常表達(dá)與食管癌細(xì)胞凋亡關(guān)系的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究運(yùn)用免疫組化技術(shù)檢測68 例食管鱗癌、35 例癌旁不典型增生及68 例正常食管黏膜組織中GRIM-19 蛋白表達(dá)，并采用TUNEL 方法檢測食管鱗癌組織中的細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，GRIM-19 蛋白在正常食管黏膜組織、癌旁不典型增生組織及食管鱗癌組織中的陽性表達(dá)率依次降低;GRIM-19 蛋白陽性表達(dá)組中腫瘤細(xì)胞AI 顯著高于陰性表達(dá)組。結(jié)果提示，GRIM-19 蛋白的低表達(dá)可能與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，且與食管鱗癌細(xì)胞的凋亡相關(guān)。該研究結(jié)果為進(jìn)一步探討食管鱗癌等惡性腫瘤的凋亡機(jī)制奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

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