全雄黃顙魚攝食前后消化酶活性變化規(guī)律的研究

■楊家威 孫龍生 蔡春光 趙 躍 楊澤禹 叢 寧

（1.揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚州225009;2.揚州市水產(chǎn)生產(chǎn)技術(shù)指導(dǎo)站，江蘇揚州225101）

黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）肉質(zhì)細嫩、味道鮮美、營養(yǎng)及藥用價值高，深受消費者喜愛，是目前主推淡水養(yǎng)殖品種。在相同養(yǎng)殖條件下，雄性黃顙魚比雌魚生長速度快30%左右，導(dǎo)致雌雄生長速度和個體大小差異懸殊。劉漢勤等[1]采用性逆轉(zhuǎn)與雌核發(fā)育的方法生產(chǎn)出全雄黃顙魚（all-mallPelteobagrus fulvidraco），解決了商品魚規(guī)格不齊問題，顯著提高了黃顙魚的產(chǎn)量和效益。近年來，人們圍繞黃顙魚消化生理，從發(fā)育階段、餌料來源、投喂頻率、酶動力學(xué)等方面對黃顙魚消化酶活性開展了相關(guān)研究。李芹等[2]研究了瓦氏黃顙魚發(fā)育過程中酶活性的變化，發(fā)現(xiàn)不同酶比活力變化模式不同，但主要消化酶活性均隨著生長而變化顯著；李芹等[3]報道，投喂活餌料組瓦氏黃顙魚蛋白酶活性高于人工飼料組，而脂肪酶和淀粉酶活性卻相反；王武等[4]研究表明，投喂頻率刺激對黃顙魚腸蛋白酶活性有顯著影響，其活性隨投喂頻率的增加而顯著降低；余濤等[5]對黃顙魚消化器官蛋白酶和淀粉酶活性進行了測定分析，結(jié)果顯示腸是黃顙魚主要的消化器官之一，其蛋白酶最適pH值為7.0，且中腸的蛋白酶和淀粉酶活性最強。有關(guān)黃顙魚攝食前后消化酶活性動態(tài)變化規(guī)律方面的研究尚未見報道。本研究旨在比較攝食前后全雄黃顙魚不同消化器官（肝胰腺、胃、腸道）消化酶活性的高低，探討全雄黃顙魚攝食前后不同時間消化酶活性的動態(tài)變化規(guī)律，為了解全雄黃顙魚消化生理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與飼養(yǎng)管理

全雄黃顙魚幼魚由高郵董氏特種水產(chǎn)養(yǎng)殖公司提供。試驗前選擇體質(zhì)健壯、規(guī)格整齊、平均體重（10.11±0.12）g的幼魚150尾，隨機分配到3個水族箱中（100 cm×40 cm×50 cm），每個水族箱50尾。試驗采用微循環(huán)水流，間隙式增氧；溫度控制在26～28℃。

1.2 試驗設(shè)計與試驗飼料

試驗飼料配方及營養(yǎng)水平見表1。飼料原料按配比定量后混合，加水揉勻，用F-26型顆粒飼料擠條機加工成粒徑為2 mm硬顆粒飼料，自然風(fēng)干后，密封保存于-20℃冰箱中備用。

試驗魚每天投喂2次（7:00和17:00），馴養(yǎng)3周。正式試驗前，試驗魚先饑餓28 h，取樣后立即投喂，并以此時間作為0 h開始計時，分別于0、1、2、4、6、8 h等6個時間點進行采樣，每組6個重復(fù)，樣品置于冰盤解剖，分別采集肝胰腺、腸和胃，迅速置于液氮凍存，-70℃保存以備消化酶活性測定。

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)，%）

1.3 消化酶活性的測定

待測組織樣品分析前于冰上解凍，除去內(nèi)容物，用雙蒸水沖洗，濾紙吸干，稱重后與預(yù)冷的去離子水按1∶9質(zhì)量體積比稀釋，冰浴中用高速組織勻漿機勻漿，勻漿液4 000 r/min、4℃離心15 min，取上清液作為粗酶液。

淀粉酶、脂肪酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶活性均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定，具體方法參見試劑盒所附說明書。

組織淀粉酶活性單位定義：組織中每毫克蛋白在37℃與底物作用30 min，水解10 mg淀粉定義為1個淀粉酶活性單位。

組織脂肪酶活性單位定義：在37℃條件下，每克組織蛋白在本反應(yīng)體系中與底物反應(yīng)1 min，每消耗1 μmol底物為1個酶活性單位。

組織胃蛋白酶活性單位定義：每毫克組織蛋白37℃每分鐘分解蛋白生成1 μg氨基酸相當于1個酶活性單位。

組織胰蛋白酶活性單位定義：在pH值8.0、37℃條件下，每毫克蛋白中含有的胰蛋白酶每分鐘使吸光度變化0.003即為1個酶活性單位。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用EXCEL記錄數(shù)據(jù)，試驗數(shù)據(jù)采用 SPSS 19.0 for Windows軟件分析，以不同時間點為影響因素，對所得數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-Way Analysis，ANOVA)，多重比較采用Duncan's法，顯著水平設(shè)定為P＜0.05。分析結(jié)果以平均值±標準差表示（Means±SD）。

2 結(jié)果

2.1 攝食前后全雄黃顙魚淀粉酶活性變化規(guī)律

攝食前后不同時間點全雄黃顙魚消化道組織淀粉酶活性的變化規(guī)律見圖1和表2。

淀粉酶活性以腸道最強，在攝食后0～8 h內(nèi)，其活性分別是肝胰腺的10～30倍、胃的10～200倍，其高低順序為腸＞肝胰腺＞胃。肝胰腺淀粉酶活性在攝食后1 h[(37.18±2.35)U/mg protein]高于攝食前[(7.39±0.50)U/mg protein]（P＜0.01），攝食后4～8 h降到最低；腸淀粉酶活性攝食后1～2 h較攝食前高[(196.40±19.87)U/mg protein]（P＜0.01），其最高值出現(xiàn)在攝食后 2 h[(374.17±0.05)U/mg protein]，除與攝食后 1 h之間差異不顯著（P＞0.05），均極顯著高于其它各時間點（P＜0.01）；胃淀粉酶活性則是攝食后極顯著低于攝食前[(11.03±1.73)U/mg protein]（P＜0.01），且攝食后1～8 h其活力一直維持在較低水平（P＞0.05）。

圖1 攝食對全雄黃顙魚淀粉酶活性的影響

表2 攝食對全雄黃顙魚淀粉酶活性的影響(U/mg)

2.2 攝食前后全雄黃顙魚脂肪酶活性變化規(guī)律

攝食前后不同時間點全雄黃顙魚消化道組織脂肪酶活性的變化規(guī)律見圖2和表3。

圖2 攝食對全雄黃顙魚脂肪酶活性的影響

脂肪酶活性高低順序為腸＞肝胰腺＞胃，但肝胰腺及腸脂肪酶活性攝食后各時間段與攝食前比較差異不顯著（P＞0.05）。相反，胃脂肪酶活性在攝食2 h明顯高于攝食0～1 h（P＜0.05），攝食后4～6h 降至較低水平（P＞0.05），攝食后8 h有升高的趨勢，但與攝食后2 h之間沒有顯著差異（P＞0.05）。

2.3 攝食前后全雄黃顙魚胃蛋白酶活性變化規(guī)律

攝食前后不同時間點全雄黃顙魚消化道組織胃蛋白活性的變化規(guī)律見圖3和表4。

胃蛋白酶主要存在于黃顙魚的胃組織、肝胰腺和腸道組織中，胃蛋白酶活性在攝食后始終維持在低水平，且胃組織中胃蛋白酶活性在各時間點均高于肝胰腺和腸。胃組織中胃蛋白酶活性在攝食后1 h[(3.71±0.31)U/mg protein]與攝食前[(4.22±0.52)U/mg]有顯著性差異（P＜0.05），攝食后2～4 h略有升高，且攝食后6～8 h維持在較低水平。

表3 攝食對全雄黃顙魚脂肪酶活性的影響(U/g)

圖3 攝食對全雄黃顙魚胃蛋白酶活性的影響

2.4 攝食前后全雄黃顙魚胰蛋白酶活性變化規(guī)律

攝食前后不同時間點全雄黃顙魚消化道組織胰蛋白酶活性的變化規(guī)律見圖4和表5。

圖4 攝食對全雄黃顙魚胰蛋白酶活性的影響

胰蛋白酶主要存在于肝胰腺和腸道組織，試驗中未檢測出胃組織中存在胰蛋白酶活性，且胰蛋白酶活性均是在攝食前最高，攝食后快速下降。肝胰腺胰蛋白酶活性在攝食后1 h[(91.62±10.33)U/mg]與攝食前[(402.03±64.41)U/mg]有極顯著性差異（P＜0.01），隨著攝食后時間的延長，胰蛋白酶活性逐漸降低，在攝食后6 h降至最低[(43.76±10.23)U/mg]，但在攝食8 h[(110.76±15.56)U/mg]有逐漸升高的趨勢；腸胰蛋白酶活性攝食前后變化規(guī)律與肝胰腺相似。

表4 攝食對全雄黃顙魚胃蛋白酶活性的影響(U/mg)

表5 攝食對全雄黃顙魚胰蛋白酶活性的影響(U/mg)

3 討論

魚類消化酶的分泌與攝食活動密切相關(guān)，攝食后消化酶的分泌既受到食物的影響，同時也受到魚體自身生理特點的約束與影響[6]；消化酶的分泌過程存在多種調(diào)節(jié)機制，但攝食食物是主要的誘導(dǎo)因素。王立波等[7]研究攝食對懷頭鲇（Silurus soldatovi）胃腸道消化酶活性影響發(fā)現(xiàn)，懷頭鲇胃蛋白酶活性在攝食后先降低后快速上升，而腸蛋白酶活性一直保持上升的趨勢，他認為蛋白酶活性在攝食后先下降后升高是肉食性魚類長期以來形成的，即在攝食前就在消化器官中儲備一定的酶，以便更有效地利用飼料中的營養(yǎng)物質(zhì)。本試驗測定了全雄黃顙魚肝胰腺、胃及腸道組織的淀粉酶活性、脂肪酶活性、胃蛋白酶活性和胰蛋白酶活性，發(fā)現(xiàn)除腸道淀粉酶活性在攝食后升高，其它消化酶的活力在攝食后均有不同程度的降低。酶活性先下降后升高的現(xiàn)象表明，攝食前組織中存在酶的基礎(chǔ)分泌現(xiàn)象，隨后酶活性持續(xù)緩慢下降說明組織分泌酶的量在減少，而此時食糜中酶的活性應(yīng)較高?？梢钥闯?，攝食刺激對全雄黃顙魚消化組織相關(guān)酶的分泌并不完全是增強，具有一定的組織差異性，其深層原因有待進一步研究。

研究顯示，魚類在進化過程中唾液腺逐漸退化，淀粉酶主要由肝臟產(chǎn)生。周景祥等[8]試驗證明，魚類淀粉酶主要由肝胰腺分泌產(chǎn)生，但倪壽文等[9]證明腸道也可以產(chǎn)生淀粉酶，且具有較高的活性。本試驗中在3種消化組織中均能檢測到淀粉酶存在，這與孫翰昌等[10]、王武等[11]研究結(jié)果相一致；魚類胃淀粉酶活性較低，且不隨飼料成分的改變而變化[12-13]，再者胃內(nèi)酸性較強，因此可以認為淀粉酶在胃內(nèi)的消化作用微乎其微。黃顙魚攝食前后，腸淀粉酶活性均高于肝胰腺和胃，在攝食后不同時間段分別是肝胰腺的10～30倍、胃的10～200倍，腸淀粉酶活性最高值出現(xiàn)在攝食后1～2 h，由此可以推測黃顙魚腸道能夠產(chǎn)生并分泌淀粉酶，且對淀粉具有較高的利用能力，此外腸道對淀粉的消化主要是在攝食后的1～2 h。

胃消化作用主要是對飼料中的蛋白質(zhì)進行初步分解，胃蛋白酶只有在強酸環(huán)境下才能分解蛋白質(zhì)，因此在3種組織中胃組織中胃蛋白酶活性遠高于肝和腸；腸中能夠檢測到胃蛋白酶活性，但其變化規(guī)律與胃組織一致，分析原因可能是胃蛋白酶隨食糜進入腸道所致。

攝食活動影響魚類消化酶的分泌，而食物的組成也是影響魚類消化酶分泌的主要因素[14]。目前魚類飼料蛋白源中植物類蛋白較多，當豆粕和菜粕類原料作為飼料蛋白源使用時，胰蛋白酶的分泌會受到抗營養(yǎng)因子的影響。田麗霞等[15]比較了魚粉和黃豆餅為蛋白源時草魚腸蛋白酶活性的變化，發(fā)現(xiàn)魚粉組在攝食后胰蛋白酶活性持續(xù)上升，而黃豆餅組在攝食0～5 h內(nèi)急劇下降，10 h上升。她認為，黃豆餅組腸組織蛋白酶活性在攝食后先有一個下降過程，這很可能是由于黃豆餅中含有抗胰蛋白酶抑制了腸內(nèi)胰蛋白酶的活性。在本試驗中，黃顙魚肝胰腺和腸道組織中的胰蛋白酶活性在攝食后急劇降低，在6 h時降至最低，隨后逐漸回升，這與田麗霞等人的研究結(jié)果一致。分析發(fā)現(xiàn)，試驗飼料原料中膨化大豆、豆粕及菜粕等占到30%，攝食后的胰蛋白酶活性急劇下降可能與飼料中抗胰蛋白酶因子有關(guān)。此外，胰蛋白酶活性在攝食后急劇下降也可能與食物刺激帶來的消化器官內(nèi)儲酶大量分泌有關(guān)。Kawis.,Ikeda[16]給鯉魚投喂市售的顆粒飼料，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝胰腺蛋白酶活性在2 h后達到最低，他推測肝胰腺和腸道分泌細胞不斷形成的消化酶積累在分泌細胞或腺泡腔內(nèi)，魚類的攝食以及食團對腸道的刺激引起消化組織內(nèi)積累的消化酶排入消化道，這導(dǎo)致消化組織的酶活性在攝食后降低，而此時腸內(nèi)容物酶活性可能升高。試驗中未對腸道內(nèi)容物胰蛋白酶活性進行檢測，有關(guān)因食物刺激而導(dǎo)致的組織胰蛋白酶活性降低這一情況有待進一步研究。

本試驗各消化酶活性是在一次性攝食后測定的，而影響消化酶活性的因素很多，攝食量、飼料蛋白質(zhì)水平以及日常投喂頻率等均會影響攝食前后酶活性的高低，有關(guān)全雄黃顙魚消化器官分泌消化酶的生理機制，還有待進一步深入研究。

4 結(jié)論

全雄黃顙魚攝食前后消化道不同消化酶活性存在時序變化和組織差異性。