丹參藥渣發(fā)酵生產(chǎn)藥用真菌多糖生物飼料研究

■戴德慧 胡偉蓮

(浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江杭州310023)

我國(guó)丹參中成藥制備常采用水浸提丹參，其水溶性浸出物和其他藥物混合制成丹參中成藥，用于治療冠心病、心絞痛、皮膚病等疾病[1]。因此在生產(chǎn)的過(guò)程中有大量的丹參水煎提取后固體廢渣殘留。僅正大青春寶藥業(yè)有限公司一年的丹參固體藥渣排放量就高達(dá)400 t以上。由于含水量較大，極易霉變，難以?xún)?chǔ)存。對(duì)丹參藥渣處理的方法仍主要是通過(guò)具有環(huán)保資質(zhì)的專(zhuān)業(yè)公司進(jìn)行清運(yùn)、填埋處理，不僅需花費(fèi)高昂的處理費(fèi)，還極易造成制藥企業(yè)的環(huán)境污染。然而這些丹參水提藥渣中除含有一些丹參脂溶性活性成分二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮ⅡA等外[2-3]，還含有大量的纖維素、木質(zhì)素及少量的蛋白質(zhì)、淀粉等可利用營(yíng)養(yǎng)成分。因此，丹參藥渣也是一種具有較高應(yīng)用前景的可再生資源。

藥用真菌是指對(duì)人體有保健作用，對(duì)疾病有治療、預(yù)防或抑制作用，其菌絲體、子實(shí)體、菌核或孢子中能產(chǎn)生氨基酸、維生素、多糖、生物堿等多種活性物質(zhì)的真菌[4]。其中產(chǎn)生藥用真菌多糖具有提高機(jī)體免疫性，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的活力，加強(qiáng)機(jī)體防御能力，促進(jìn)白細(xì)胞對(duì)病毒菌和異常細(xì)胞吞噬功能，消除體液中自由基的產(chǎn)生，防止細(xì)胞膜質(zhì)的氧化，保護(hù)正常細(xì)胞等作用[5-7]。因此，食用富含真菌多糖的飼料可以提高家畜的機(jī)體抵抗力，減少抗生素的使用。

本文采用固態(tài)發(fā)酵方式對(duì)甲醇提取處理后的丹參水提藥渣進(jìn)行再一步資源化處理。利用藥用真菌靈芝G1、產(chǎn)朊假絲酵母C01、植物乳桿菌L01等多種微生物混合發(fā)酵制成藥用真菌多糖微生態(tài)飼料，為丹參藥渣資源化再生利用開(kāi)辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

冬蟲(chóng)草C11，C12，C13（Cordyceps sine C11，C12，C13）；靈芝 G1，G2，G3，G8（Ganoderma lucidum G1，G2，G3，G8）；北蟲(chóng)草 C01、C02（Cordyceps militaris C01，C02）；茯苓 P01（Poria cocos P01）；豬苓 P11（Polyporus umbellatus P11）；香菇L01、L02（Lentinus edodes L01，L02）；猴頭H01、H02（Hericium erinaceus H01，H02）；產(chǎn)朊假絲酵母 C01（Candida tropicalis C01）；植物乳桿菌 L01（Lactobacillus plantarum L01）均為本實(shí)驗(yàn)室收藏并編號(hào)。

1.1.2 丹參藥渣

新鮮的丹參水提藥渣采自正大青春寶藥業(yè)有限公司。藥渣采集以后自然曬干，按料液比1∶9，加入80%甲醇在60℃的溫度下回流3 h提取丹參酮ⅡA等脂溶性成分，處理后的丹參殘?jiān)?，烘干待進(jìn)一步處理。

1.1.3 培養(yǎng)基

①斜面培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)

馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 ml,pH值自然。

②篩選培養(yǎng)基

初篩培養(yǎng)基：在PDA培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加15%丹參藥渣。

復(fù)篩培養(yǎng)基：丹參藥渣1 000 g，麩皮250 g，水1 000 ml。

③植物乳桿菌培養(yǎng)及計(jì)數(shù)培養(yǎng)基

蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母膏5 g、葡萄糖20 g、磷酸氫二鉀2 g、檸檬酸二銨 2 g、吐溫80 1 ml、硫酸鎂0.58 g、硫酸錳0.25 g，瓊脂15～20 g,用水定容至1 000 ml。

④酵母培養(yǎng)及計(jì)數(shù)培養(yǎng)基

麥芽浸粉20 g，瓊脂20 g，水1 000 ml。

⑤靈芝液體種子培養(yǎng)基

玉米粉20 g，葡萄糖20 g,酵母膏4 g，丹參藥渣30 g，水1 000 ml，pH值6.0。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 丹參藥渣發(fā)酵藥用真菌篩選

將收集的各種藥用真菌在PDA平板上活化，待菌體長(zhǎng)滿(mǎn)后，用打孔器取出一小塊菌體置于平板篩選培養(yǎng)基的中間，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察菌體生長(zhǎng)情況，比較各菌株的生長(zhǎng)速度。選取在平板篩選培養(yǎng)中生長(zhǎng)速度較快的菌株，經(jīng)三角瓶液體種子擴(kuò)大培養(yǎng)后，接種于滅菌過(guò)的藥渣復(fù)篩培養(yǎng)基中，選擇生長(zhǎng)速度最快的菌株進(jìn)一步研究。

1.2.2 發(fā)酵方法

將丹參、麩皮以一定比例混合后，再加入適量的水混合均勻配制成固體發(fā)酵培養(yǎng)基，靈芝G01、植物乳桿菌L01及產(chǎn)朊假絲酵母C01按一定的配比進(jìn)行，在28℃的培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)至菌絲鋪滿(mǎn)整個(gè)培養(yǎng)基。

1.2.3 植物乳桿菌L01及產(chǎn)朊假絲酵母C01數(shù)量的測(cè)定

待錐形瓶?jī)?nèi)鋪滿(mǎn)菌絲后，取出5.0 g培養(yǎng)基，加入45 ml的無(wú)菌水中，再?gòu)闹腥〕? ml進(jìn)行梯度稀釋至合適倍數(shù)，分別涂布MRS和麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基平板。在MRS平板上根據(jù)植物乳桿菌L01的菌落形態(tài)選取計(jì)數(shù)，在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)產(chǎn)朊假絲酵母C01的菌落數(shù)。

1.2.4 理化分析方法

粗蛋白的測(cè)定參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 6432-1994；含水率的測(cè)定參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 6435-1986；粗纖維的測(cè)定參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 6434-1994；可溶性多糖含量的測(cè)定參照參考邵穎(2007)[8]。真蛋白測(cè)定參照參考劉常青(2011)[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 丹參藥渣發(fā)酵藥用真菌的篩選

為了得到在丹參藥渣中能快速生長(zhǎng)的藥用真菌菌株，對(duì)15株菌種進(jìn)了篩選，其生長(zhǎng)情況見(jiàn)表1。

表1 各藥用真菌菌株在丹參藥渣中的生長(zhǎng)情況

由表1可知，所選用藥用真菌均能在丹參藥渣平板培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)速度有較大的差距，其中靈芝、茯苓、豬苓生長(zhǎng)速度較快，而香菇、猴頭菌生長(zhǎng)較慢。選取了在平板上生長(zhǎng)最快的7個(gè)菌株進(jìn)行了復(fù)篩，在復(fù)篩培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較快的是茯苓及豬苓，8～9 d就可鋪滿(mǎn)整個(gè)培養(yǎng)基，靈芝及冬蟲(chóng)草相對(duì)生長(zhǎng)較慢。但菌絲的致密度上，靈芝及蟲(chóng)草菌絲致密，茯芩及豬苓菌絲稀疏，生物量較低。真菌多糖是真菌的一種初級(jí)代謝產(chǎn)物，與真菌的菌絲生長(zhǎng)量成正相關(guān)。為了在丹參藥渣中獲得較多藥用真菌多糖，必須快速得到大量的菌絲體。因此，綜合考慮，選用靈芝G1為發(fā)酵藥用真菌對(duì)丹參藥渣進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，以期開(kāi)發(fā)富含真菌多糖的生物飼料。

2.2 初始水分含量對(duì)丹參藥渣發(fā)酵的影響

按丹參與麩皮75∶25的比例配制固體培養(yǎng)基，初始水分控制在45%、55%、65%、75%等4個(gè)梯度。靈芝G1、植物乳桿菌L01、產(chǎn)朊假絲酵母C01分別以10%、0.5%、0.5%的接種量進(jìn)行接種，28℃持續(xù)培養(yǎng)至靈芝菌絲鋪滿(mǎn)。以最短鋪滿(mǎn)菌絲組時(shí)間測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)，其結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同水分含量對(duì)丹參藥渣發(fā)酵的影響

水分含量是固態(tài)發(fā)酵中影響微生物生長(zhǎng)的一個(gè)重要指標(biāo)，其對(duì)微生物生成及代謝影響較大，適宜水分含量是固態(tài)發(fā)酵中微生物生長(zhǎng)的前提。由表2可知。當(dāng)初始水分含量在65%時(shí)有利于靈芝、植物乳桿菌L01、產(chǎn)朊假絲酵母C01三種微生物的生長(zhǎng)需要，靈芝只需13 d菌絲就能鋪滿(mǎn)整個(gè)培養(yǎng)基。與發(fā)酵前的基料相比，經(jīng)發(fā)酵后物料中可溶性多糖與真蛋白分別增加了79.1%及23.8%。而初始水分含量在45%時(shí)，由于發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)，水分蒸發(fā)量較大，靈芝菌在后期基本停止生長(zhǎng)，20 d后仍未能鋪滿(mǎn)培養(yǎng)基。

2.3 原料配比對(duì)丹參藥渣發(fā)酵的影響

丹參與麩皮分別以不同的比例配制固體培養(yǎng)基，接種三種微生物，28℃持續(xù)培養(yǎng)至靈芝菌絲鋪滿(mǎn)。以最短鋪滿(mǎn)菌絲組時(shí)間測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)，其結(jié)果見(jiàn)表3。

麩皮在固態(tài)發(fā)酵中不僅可以提供營(yíng)養(yǎng)成分，也可以起到疏松基質(zhì)的作用，是固態(tài)發(fā)酵中常用的基質(zhì)。由表3可知，在丹參藥渣中適當(dāng)?shù)奶砑右欢康柠熎?，可以促進(jìn)靈芝G1、植物乳桿菌L01、產(chǎn)朊假絲酵母C01的生長(zhǎng)。但麩皮添加過(guò)多，對(duì)靈芝菌的生長(zhǎng)有一定的抑制，延長(zhǎng)了菌絲生長(zhǎng)周期。這可能是因?yàn)殪`芝G1對(duì)碳氮源比例要求較高，當(dāng)麩皮過(guò)多，碳氮比不適宜其生長(zhǎng)。

2.4 靈芝接種量對(duì)丹參藥渣發(fā)酵的影響

在植物乳桿菌L01、產(chǎn)朊假絲酵母C01接種量保持不變的條件下，靈芝G1分別按基料的5%，10%，15%，20%的比例接種培養(yǎng)好的液體菌種。28℃持續(xù)培養(yǎng)至靈芝菌絲鋪滿(mǎn)。以最短鋪滿(mǎn)菌絲組時(shí)間測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)，其結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 不同原料配比對(duì)丹參藥渣發(fā)酵的影響

表4 不同靈芝菌種接種量對(duì)丹參藥渣發(fā)酵的影響

由表4可知，靈芝G1接種量與菌絲體的生長(zhǎng)成正相關(guān)，接種量大菌絲生長(zhǎng)快，生物量高，菌絲鋪滿(mǎn)基料時(shí)間短，可溶性多糖增加率高。這主要是因?yàn)樵诮臃N量大時(shí)，菌絲萌發(fā)快,萌發(fā)點(diǎn)多。但接種量超過(guò)一定比例后，菌絲的生長(zhǎng)趨于飽和，可溶性多糖增加率增加不明顯。同時(shí)過(guò)高的接種量會(huì)增加靈芝菌體擴(kuò)大培養(yǎng)次數(shù)，增加設(shè)備投資和染菌機(jī)率，且靈芝菌的接種量過(guò)高對(duì)熱帶假期絲酵母及植物乳酸菌的生長(zhǎng)也有一定的抑制作用。降低了單細(xì)胞蛋白的轉(zhuǎn)化。綜合考慮，選擇15%的靈芝G1接種量有利于丹參藥渣飼料的開(kāi)發(fā)。

2.5 丹參藥渣發(fā)酵藥用真菌微生態(tài)飼料主要指標(biāo)

將發(fā)酵完成后的丹參藥渣培養(yǎng)物進(jìn)行50℃低溫鼓風(fēng)干燥至恒重，發(fā)酵物的性狀見(jiàn)圖1。

藥渣發(fā)酵后菌絲體的生長(zhǎng)使得丹參呈現(xiàn)顆粒狀或結(jié)成塊狀，烘干后的藥渣發(fā)酵成品表面呈灰白色，斷面疏松夾雜有白色菌絲體，具有濃烈菇香味，無(wú)任何不良?xì)馕丁？扇苄远嗵羌按值鞍缀糠謩e為14.4%及11.2%。與發(fā)酵前相比可溶性多糖含量提高了103.8%，而粗蛋白含量無(wú)顯著差異。

3 討論

3.1 在丹參藥渣的資源化利用方面，劉常青等(2011)[10]報(bào)道主要集中提取回收丹參酮ⅡA等脂溶性物質(zhì)。這種處理方法雖可提高丹參藥渣資源化利用，但不能徹底解決丹參藥渣的殘留，其殘?jiān)孕枰M(jìn)一步處理。本文在丹參水提藥渣回收丹參酮ⅡA等脂溶性物質(zhì)基礎(chǔ)上，通過(guò)藥用真菌為主的多菌種混合發(fā)酵丹參藥渣，將纖維素、木質(zhì)素等難利用的成分轉(zhuǎn)化為可溶性藥用真菌多糖，提高了營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。并且整個(gè)處理過(guò)程中無(wú)廢取物排放，無(wú)二次污染。

圖1 丹參藥渣發(fā)酵產(chǎn)物

3.2 在農(nóng)副產(chǎn)品廢取物再利用研究中，利用酵母或

細(xì)菌發(fā)酵增加基質(zhì)中蛋白質(zhì)的含量，開(kāi)發(fā)富含菌體蛋白飼料是一種較好的方法。但部分研究者用凱氏定氮法測(cè)定的粗蛋白（總氮）為研究指標(biāo)值得商榷，因?yàn)榇蠖鄶?shù)使用的發(fā)酵菌種無(wú)固氮能力，粗蛋白在發(fā)酵過(guò)程不會(huì)顯著增加，且有可能因發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生少量的氨排出而使粗蛋白含量減少，使用真蛋白作為參考指標(biāo)應(yīng)可以更好的反應(yīng)出基質(zhì)中菌體蛋白轉(zhuǎn)化。

3.3 傳統(tǒng)的藥用真菌固體培養(yǎng)一般采用固體菌種接種，菌絲萌發(fā)時(shí)間及生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，且所需接種量大，污染機(jī)率高。而液體菌種生產(chǎn)周期短、菌齡整齊一致、接種方便、發(fā)酵快、適宜于工廠化生產(chǎn)[11]。在前期的試驗(yàn)中，采用靈芝液體菌種能顯著縮短菌絲鋪滿(mǎn)基料的時(shí)間，且有利于三種微生物的混合生長(zhǎng)，而采用靈芝固體菌種時(shí)，在丹參藥渣中生長(zhǎng)的主要以產(chǎn)朊假絲酵母為主，而靈芝菌絲生產(chǎn)較少。

4 結(jié)論

4.1 收集的15株藥用真菌均能利用丹參藥渣進(jìn)行生長(zhǎng)，其中靈芝G1具有較快生長(zhǎng)速度和較高的生物量。

4.2 以靈芝G1、植物乳桿菌L01、產(chǎn)朊假絲酵母C01為發(fā)酵菌種，對(duì)丹參藥渣進(jìn)行了固態(tài)發(fā)酵轉(zhuǎn)化資源化處理。當(dāng)初始水分含量為65%，丹參與麩皮比例為75∶25，靈芝G1接種量為15%時(shí)，發(fā)酵后可溶性多糖含量與發(fā)酵前基質(zhì)相比有較大幅度的提高，其增加率為103.8%，真蛋白含量有也所提高，其增加率為14.3%，但粗蛋白含量無(wú)明顯變化。