干擾素誘導(dǎo)表達(dá)跨膜蛋白基因家族的功能研究

■ 王 凱 孫亭亭 高杰鋒 史洪亮2，

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201；2.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234；3.上海柏慧康生物科技有限公司,上海201203)

固有免疫系統(tǒng)迅速啟動對抗感染的機(jī)制，包括體液成分和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫成分。固有免疫系統(tǒng)幾乎存在于所有種類的動物和植物。對固有免疫分子在抗病毒感染免疫應(yīng)答中的作用及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的深入認(rèn)識，人們在探究病毒與宿主之間的相互作用中取得了長足的進(jìn)步,這可能為闡明機(jī)體抗感染免疫的分子機(jī)制及疾病的發(fā)病機(jī)制研究提供新的思路，也將為藥物設(shè)計和疫苗研制提供新的靶點(diǎn)。

近年來，抗病毒感染的固有免疫研究逐漸成為免疫生物學(xué)的熱點(diǎn)。干擾素導(dǎo)跨膜蛋白(interferon inducible transmembrane proteins,IFITM)的抗病毒作用及其機(jī)制已成為研究熱點(diǎn)。當(dāng)前病毒載體和非病毒載體系統(tǒng)的研究取得了一定進(jìn)展。干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白結(jié)合慢病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白的持續(xù)過表達(dá)型或許可以克服固有免疫系統(tǒng)持續(xù)性差的不足，為深入研究干擾素導(dǎo)跨膜蛋白和固有免疫系統(tǒng)提供一定的幫助。

1 固有性免疫的特點(diǎn)與作用

固有性免疫又叫先天性免疫、自然免疫，一種非特異、無記憶性的機(jī)體通過遺傳獲得的防御系統(tǒng)的總稱。固有免疫系統(tǒng)又叫非特異性免疫系統(tǒng)、先天性免疫系統(tǒng)。固有免疫系統(tǒng)是機(jī)體全身免疫系統(tǒng)的一個亞系統(tǒng)，包含免疫細(xì)胞和機(jī)體防御外來生物感染的非特異性免疫機(jī)制。不像非特異性免疫系統(tǒng)主要存在于高等脊椎動物，固有免疫系統(tǒng)廣泛分布于多數(shù)動物機(jī)體，但是固有免疫系統(tǒng)不能給機(jī)體提供持續(xù)性保護(hù)。

一般認(rèn)為固有免疫系統(tǒng)具有以下功能：通過釋放特異性細(xì)胞因子來招募免疫細(xì)胞到感染位點(diǎn)；激活補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)以識別細(xì)菌，激活免疫細(xì)胞加速清除抗體復(fù)合物和死亡細(xì)胞；通過白細(xì)胞來識別并清除器官、組織、血液和淋巴中的外來物質(zhì)；以抗原遞呈的機(jī)制激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng)；作為抵抗病原入侵的物理和化學(xué)屏障。

病毒感染性疾病仍然是人類歷史上最難處理的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)。實(shí)際上機(jī)體激活抗病毒反應(yīng)和進(jìn)入一個高效的抗病毒狀態(tài)主要依賴于I型干擾素(type I interferons,IFN)的作用，主要由樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)分泌。

2 病毒的免疫逃避機(jī)制

總會有病毒逃避機(jī)體的免疫系統(tǒng)，進(jìn)而感染機(jī)體細(xì)胞。許多病毒能夠產(chǎn)生一些小分子作用于干擾素表達(dá)通路，下調(diào)干擾素的表達(dá)進(jìn)而規(guī)避免疫系統(tǒng)的殺傷作用。例如，甲型流感病毒的NS1蛋白可結(jié)合單鏈或雙鏈RNA，阻礙了干擾素下游蛋白激酶R的激活，限制I型干擾素的生成量，使機(jī)體不能有效提高抗病毒反應(yīng)能力。登革熱病毒的蛋白酶復(fù)合體NS2B3能夠阻斷IRF-3的磷酸化從而下調(diào)I型干擾素的生成量。

3 干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白家族的功能研究

干擾素是由高等脊椎動物產(chǎn)生的多功能細(xì)胞因子，在先天免疫系統(tǒng)中占據(jù)重要地位，具有抑制腫瘤生長的作用，此外還具有抑制多種病毒的復(fù)制的作用。最近研究發(fā)現(xiàn)干擾素細(xì)胞在細(xì)胞發(fā)育過程中具有重要作用。IFNs主要有I型和II型兩種類型。I型包括IFN-α和IFN-β兩類，可在病毒感染后可由許多類型的細(xì)胞合成。II型主要指IFN-γ，是由免疫細(xì)胞分泌。

干擾素跨膜誘導(dǎo)蛋白屬于CD225基因家族，高度保守和廣泛表達(dá)。人類有5個IFITM基因座，IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5 和 IFITM10。其中 IFITM1、IFITM2、IFITM3統(tǒng)稱為免疫相關(guān)干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白，被稱作病毒限制因子。

3.1 IFITM蛋白的抗病毒功能研究

近年來的研究發(fā)現(xiàn)它們具有廣泛的抗病毒作用。目前，研究發(fā)現(xiàn)IFITM蛋白具有限制蟲媒病毒、甲型流感病毒、線狀病毒、水皰性口炎病毒、呼吸道腸道病毒、布尼亞病毒。但是對沙粒病毒、阿爾法病毒（如淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒小鼠白血病病毒（MLV））等則不起作用。

一些研究結(jié)果表明，IFITM1、IFITM2、IFITM3蛋白限制HIV-1感染，但是不同細(xì)胞系中IFITM1、IFITM2、IFITM3蛋白對HIV-1的限制作用不同，并且限制作用不確定是否依賴于特異性的限制病毒進(jìn)入細(xì)胞。IFITM3優(yōu)先與病毒囊膜結(jié)合，進(jìn)而限制宿主細(xì)胞膜與病毒囊膜的融合，從而發(fā)揮抗病毒作用。IFITM3基因的變異將導(dǎo)致嚴(yán)重的肺炎。

IFITM5其實(shí)不是干擾素誘導(dǎo)表達(dá)的，在骨的生成過程中起作用，該基因的突變可導(dǎo)致V型成骨不全癥。IFITM10的功能目前還沒有揭示。

小鼠擁有與人類同源的5個ifitm基因和2個額外的不知功能的ifitm6和ifitm7。單獨(dú)敲除小鼠的ifitm3 或ifitm1、ifitm2、ifitm3、ifitm5、ifitm6 后小鼠可存活并且可生育但對甲型流感的抵抗力大大減弱。盡管IFITMs過表達(dá)時大多數(shù)鼠離體細(xì)胞表現(xiàn)不同程度的病毒限制活性，但是只有IFTM3在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出對甲型流感病毒具有控制能力。

在大多數(shù)細(xì)胞系中，IFITM集中于晚期的內(nèi)體和溶酶體，同時病毒也是在該處進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。IFITM蛋白的過表達(dá)引起細(xì)胞核周圍的CD63(cluster of differentiation 63)和溶酶體相關(guān)蛋白2(LAMP2)小泡的增加。對熒光壽命成像顯微分析揭示IFITM豐富的小泡膜結(jié)構(gòu)相比無IFITM的膜的穩(wěn)定性更高。Amini Bavil Olyaee等最近研究表明這些小泡含有豐富的膽固醇，同時確認(rèn)了IFITM3和囊泡相關(guān)膜蛋白A(VAPA)的一個物理相互作用并推測該相互作用與膽固醇在IFITM蛋白豐富的內(nèi)體和溶酶體積累有關(guān)，通過擾亂VAMP和氧甾酮結(jié)合蛋白的相互聯(lián)系。基于以上研究，IFITM蛋白增加內(nèi)體和溶酶體膜的穩(wěn)定性，限制病毒膜融合，從而抑制病毒入侵。

3.2 IFITM蛋白的抗癌功能研究

最近的研究確認(rèn)了IFITM可能的抗癌作用機(jī)理。小鼠中IFITM1和IFITM3在星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞的表達(dá)水平相比正常星形膠質(zhì)細(xì)胞要高得多。而且IFITM1在臨床上被認(rèn)為與膠質(zhì)瘤患者的致癌作用和侵襲性相關(guān)。同樣的IFITM2是起決定性的作用的不依賴p53基因的前-凋亡基因，調(diào)控癌細(xì)胞凋亡通路?？茖W(xué)家們首先從腫瘤組織和嚴(yán)重的潰瘍性結(jié)腸炎的病人的黏膜分離得到ifitm3基因，被稱作潰瘍性結(jié)腸炎導(dǎo)致的結(jié)腸癌優(yōu)先的標(biāo)志。此外，在胃癌、大腸癌等癌癥中IFTM3的表達(dá)量增加。

3.3 IFITM蛋白的多功能研究

最近研究發(fā)現(xiàn)，IFITM1、IFITM3與早期原生干細(xì)胞的遷移相關(guān)。Ulrike C.Lange等通過染色體打靶技術(shù)構(gòu)建缺失ifitm基因座或僅破壞ifitm3的突變?nèi)旧w來研究早期干細(xì)胞的發(fā)育行為，研究發(fā)現(xiàn)ifitm與早期肝細(xì)胞的遷移沒有相關(guān)性。

通過對精神分裂癥死亡病例的腦組織的全基因組表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，患有該病的死者腦組織基因表達(dá)復(fù)雜，呈現(xiàn)一定的區(qū)域特異性。Y Hwang等發(fā)現(xiàn)與正常人相比精神分裂癥患者大腦海馬角表現(xiàn)IFITM1、IFITM2、IFITM3表達(dá)上調(diào)的特征，并通過實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)大腦海馬角部位異常的免疫炎性反應(yīng)能導(dǎo)致認(rèn)知障礙，進(jìn)而發(fā)展為精神分裂癥。IFITM基因家族在大腦主要表達(dá)于大腦內(nèi)皮細(xì)胞和腦脊膜，其中腦脊膜在中間神經(jīng)元的發(fā)育過程中起著重要的作用，大腦海馬角IFITM表達(dá)異常上調(diào)可能會加重精神分離病人的癥狀。Szatmár Horváth等認(rèn)為IFITM3可作為一個有應(yīng)用前景的藥物靶送位點(diǎn)。

3.4 IFITM3蛋白的抗病毒功能研究

在IFITM家族中IFITM3在病毒感染、腫瘤、呼吸道疾病、結(jié)核病等方面的研究取得了較大的進(jìn)展，成為新的調(diào)控治療靶點(diǎn)。

中國科學(xué)院巴斯德研究所Zhao Shan等研究發(fā)現(xiàn)水皰性口炎病毒和甲型流感病毒能夠通過促進(jìn)賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶SET7和IFITM3的相互結(jié)合來引起IFITM3蛋白第88位賴氨酸甲基化，以下調(diào)其抗病毒功能。同時研究發(fā)現(xiàn)IFN-α下調(diào)IFITM3第88位賴氨酸的甲基化水平。他們的研究增進(jìn)了對IFITM3抗病毒功能的調(diào)控的認(rèn)識，對于開發(fā)新的治療靶標(biāo)提供了重要的幫助。

日本腦炎病毒通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，在感染細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)試。中國科學(xué)院武漢病毒所Lei-Ke Zhang等等采用亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分餾的策略，運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)、質(zhì)譜技術(shù)、生物信息學(xué)方法分析了日本乙型腦炎病毒感染Hela細(xì)胞后的158個宿主蛋白的表達(dá)調(diào)控。其中，敲除ifitm3基因能顯著提高日本腦炎病毒的復(fù)制速度。

Bing Zhao等通過慢病毒介導(dǎo)的ifitm3基因功能敲低細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)IFITM3蛋白表達(dá)水平能夠抑制腫瘤的發(fā)生。完全敲除ifitm3基因則會引起U251細(xì)胞停留在G0/G1期。Trans Well實(shí)驗(yàn)證實(shí)了通過RNAi技術(shù)沉默ifitm3基因的表達(dá)可以顯著降低腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的遷移能力。通過RNAi技術(shù)下調(diào)IFITM3蛋白的下調(diào)或許可以成為延緩腦膠質(zhì)瘤生長的一種潛在途徑。

Tara C.Mills等通過對社區(qū)低致病性呼吸道病毒易感病人群的ifitm3基因單核苷酸多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，rs12252稀有等位基因純合型與呼吸道病毒易感性呈正相關(guān)，而且變現(xiàn)為多種呼吸道病毒混合感染。近年來，全世界小兒科肺結(jié)核感染人數(shù)呈現(xiàn)快速增加的趨勢。Chen Shen等通過對漢族人群ifitm3的功能性啟動子rs3888188的多態(tài)性分析，揭示了rs3888188表現(xiàn)為GG基因型相比TT和GT基因型有更大的幾率感染小兒科肺結(jié)核。

4 討論與展望

IFITM蛋白的抗病毒功能已經(jīng)在人和老鼠方面的研究中取得一系列進(jìn)展，但涉及豬、牛、羊等具有重要經(jīng)濟(jì)價值的家畜的研究較少。與歐美國家以牛肉供應(yīng)為主不同，豬肉在我國的肉類供應(yīng)中占據(jù)支配地位，豬肉供應(yīng)的起伏往往成為助推我國CPI指數(shù)高企的推動因素。而豬的各種病毒病是導(dǎo)致生豬生產(chǎn)成本較高的制約因素，疫苗免疫往往只能針對一種病毒病，而免疫無效和免疫副反應(yīng)是養(yǎng)殖戶不積極推廣免疫接種的主因。疫苗接種防疫不全面，豬病的反復(fù)無序發(fā)作成為我國生豬生產(chǎn)難以矯正的頑疾。

IFITM蛋白家族是病毒等外源刺激作用于宿主細(xì)胞后由干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗病毒蛋白，其中IFITM3的抗病毒感染作用在IFITM蛋白家族成員中是最突出，尤其是在抑制囊膜病毒早起感染過程中發(fā)揮重要作用。

總之，將IFITM3的抗病毒研究應(yīng)用于豬、牛、羊等具有較大經(jīng)濟(jì)價值的家畜的病毒病預(yù)防中，將會對動物疫病的預(yù)防產(chǎn)生重大影響。對干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白家族成員的研究會進(jìn)一步加深對固有免疫反應(yīng)通路的認(rèn)識，推動轉(zhuǎn)ifitm基因抗病毒豬的研究。豬IFITM轉(zhuǎn)基因模型的建立會對人類臨床醫(yī)學(xué)研究產(chǎn)生推動作用，對促進(jìn)人類健康產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。

（參考文獻(xiàn)51篇，刊略，需者可函索）