飼料中添加抗菌脂肽對(duì)吉富羅非魚生長(zhǎng)性能和腸道消化酶活性的影響

■史慶超 盧俊姣 陸 鵬 郭清雄 翟少偉

（1.集美大學(xué)農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門361021；2.福建正源飼料有限公司，福建莆田351100）

近年來，水產(chǎn)養(yǎng)殖病害頻發(fā)，使用抗生素的種類增多，劑量越來越大，造成動(dòng)物腸道菌群破壞，體內(nèi)藥物殘留和耐藥性菌株產(chǎn)生，各個(gè)國(guó)家對(duì)抗生素等藥物的限制日趨嚴(yán)格。

因此，研發(fā)安全環(huán)保、促生長(zhǎng)且無殘留的抗生素替代品迫在眉睫。來自動(dòng)、植物和微生物的抗菌肽因具有分子量小、水溶性好、耐熱性強(qiáng)、無免疫原性、無毒副作用、無殘留且不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)[1]，被認(rèn)為是最佳抗生素替代品。但是動(dòng)物源抗菌肽的抗菌譜較窄，通常大多抑制革蘭氏陽性菌[2]，且多為基因重組后所得，應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物中可能存在飼料安全問題?？咕模╝ntimicrobial lipopeptides,AMI）是由枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）天然發(fā)酵產(chǎn)生的一種微生物源抗菌肽，與動(dòng)物源抗菌肽相比，抗菌譜更廣，對(duì)抗細(xì)菌[3]、真菌[4]、病毒[5]、原蟲[6]、支原體[7]和腫瘤[8]均有抑制作用。都海明等[9-10]研究發(fā)現(xiàn)，AMI還可以提高AA肉雞和斷奶仔豬的生產(chǎn)性能。目前已報(bào)道的應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物飼料中的抗菌肽主要有天蠶素抗菌肽[11]、家蠅抗菌肽[12]、對(duì)蝦抗菌肽[13]。關(guān)于AMI在水產(chǎn)動(dòng)物飼料中的應(yīng)用研究未見報(bào)道。本試驗(yàn)以吉富羅非魚（genetic improvement of farmed Tilapia,GIFT,Oreochromis niloticus）為研究對(duì)象，探討AMI對(duì)吉富羅非魚生長(zhǎng)性能和腸道消化酶活性的影響，為AMI作為新型抗生素替代品的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)用吉富羅非魚購(gòu)于福建省漳州市水產(chǎn)開發(fā)中心。暫養(yǎng)2周后，將320尾健康無病、規(guī)格均勻、平均體重為（9.39±0.03）g的吉富羅非魚隨機(jī)分為4個(gè)處理組（每個(gè)處理組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20尾魚），分別投喂在基礎(chǔ)飼料中添加 0（對(duì)照組）、12.5、25 mg/kg和50 mg/kg AMI（由福建正源飼料有限公司提供）的試驗(yàn)飼料。試驗(yàn)在福建正源飼料魚類養(yǎng)殖試驗(yàn)場(chǎng)進(jìn)行，試驗(yàn)期為7周。

1.2 基礎(chǔ)飼料與飼養(yǎng)管理

基礎(chǔ)飼料根據(jù)SC/T 1025—2004《羅非魚配合飼料》配制，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。所有飼料原料粉碎過40目篩，混合均勻后擠壓成直徑為3 mm的顆粒料，自然風(fēng)干后置于自封袋中，-20℃冷凍保存。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

試驗(yàn)魚以重復(fù)為單位飼養(yǎng)于120 cm×60 cm×70 cm的水族箱中，實(shí)際水體積約為100 L，開循環(huán)水系統(tǒng)，24 h充氣。日投餌量為魚體重的3.0%～5.0%，每日投喂3次(08:00、13:00和18:00)，每次飽食投喂，飼料基本無浪費(fèi)。投喂30 min后吸取殘餌和糞便，日換水量為30%。試驗(yàn)用水為曝氣自來水，光照為自然光源，增氧機(jī)持續(xù)增氧。每天監(jiān)測(cè)水質(zhì)狀況。試驗(yàn)期間水溫22～28 ℃，pH值7.5±0.3，溶氧濃度＞7.0 mg/l，氨氮濃度＜0.2 mg/l。

1.3 樣品采集與組織勻漿的制備

試驗(yàn)結(jié)束后，禁食24 h，撈取每個(gè)水箱中所有試驗(yàn)魚稱總重；每缸隨機(jī)選擇6尾規(guī)格一致的試驗(yàn)魚，麻醉后尾靜脈取血，采集后立即離心(3 000 r/min，10 min)，取血清保存于-80℃冰箱。采血后的試驗(yàn)魚解剖，取腸道，液氮速凍后-80℃冷凍保存。去除內(nèi)臟團(tuán)后的部分放入自封袋，于-20℃下保存，用于測(cè)定魚體成分。

將保存于-80℃的腸道組織樣品在冰上解凍，取組織塊1～3 g在0.86%冰冷生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重，放入勻漿玻璃管中，按比例（1 g樣品∶10 ml生理鹽水）加入0.86%冰凍生理鹽水，用玻璃勻漿機(jī)勻漿(10 s/次，間隙30 s，連續(xù)3～5次)。將制備好的10%組織勻漿在4℃下3 000 r/min離心10 min，取上清液分到1.5 ml離心管中。

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4.1 生長(zhǎng)指標(biāo)

日攝食量（DFI,g/尾）=F/t;

增重率（WGR，%）=100×(Wt-W0)/W0;

特定生長(zhǎng)率（SGR，%/d）=100×(lnWt-lnW0)/t;

飼料系數(shù)（FCR）=F/(Wt-W0);

日攝食率（FR,%）=100×F/[(W0+Wt)/2]/t。

式中：W0——初始體重（IBW，g/尾）；

Wt——終末體重（FBW，g/尾）；

F——平均每尾魚攝食飼料總量(風(fēng)干樣重)(g)；

t——飼喂天數(shù)（d）。

1.4.2 腸道消化酶活性

腸道蛋白酶活性的測(cè)定采用福林-酚試劑法，以磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液調(diào)節(jié)pH值，680 nm處測(cè)吸光值。腸道脂肪酶和淀粉酶活性采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.5 統(tǒng)計(jì)與分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）”表示，用SPSS 17.0分析軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），若存在顯著的差異，則采用Duncan's法進(jìn)行多重比較，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 飼料中添加AMI對(duì)吉富羅非魚生長(zhǎng)性能的影響（見表2）

表2 飼料中添加AMI對(duì)羅非魚生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，各AMI添加組的FBW（終末體重）、WGR、SGR和DFI均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），F(xiàn)CR顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），50 mg/kg添加組的FBW、WGR和SGR顯著高于12.5 mg/kg和25 mg/kg添加組（P＜0.05），F(xiàn)CR顯著低于12.5 mg/kg和25 mg/kg添加組（P＜0.05）,12.5 mg/kg和25 mg/kg添加組間的FBW、WGR、SGR和FCR無顯著差異（P＞0.05），各AMI添加組間DFI無顯著差異（P＞0.05）。各試驗(yàn)組間FR無顯著差異（P＞0.05）。

2.2 飼料中添加AMI對(duì)吉富羅非魚腸道消化酶活性的影響（見表3）

表3 飼料中添加AMI對(duì)羅非魚腸道消化酶活性的影響(U/mg prot)

由表3可知，各AMI添加組脂肪酶和蛋白酶活性顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，各AMI添加組間脂肪酶活性無顯著差異(P＞0.05)，50 mg/kg添加組蛋白酶活性顯著高于12.5 mg/kg和25 mg/kg添加組(P＜0.05)，12.5 mg/kg和25 mg/kg添加組間蛋白酶活性無顯著差異(P＞0.05)；各試驗(yàn)組間淀粉酶活性無顯著差異(P＞0.05)。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，飼料中添加12.5～50 mg/kg AMI可顯著提高吉富羅非魚的WGR和SGR，并顯著降低FCR，表明飼料中添加AMI能夠促進(jìn)吉富羅非魚的生長(zhǎng)，提高飼料利用率。目前，微生物源抗菌肽在魚類飼料中的應(yīng)用研究鮮見報(bào)道，而動(dòng)物源抗菌肽在魚類飼料中應(yīng)用較多。姜珊等[14]研究表明，在飼料中添加5～10 mg/kg對(duì)蝦抗菌肽可以提高吉富羅非魚幼魚WGR；Zhou等[15]報(bào)道，飼料中添加15～30 mg/kg蜜蜂抗菌肽可以顯著提高鯉魚WGR，并顯著降低FCR；林鑫等[16]在飼料中添加150 mg/kg天蠶素抗菌肽有利于提高錦鯉的SGR；陳冰等[12]在凡納濱對(duì)蝦飼料中添加3 000 mg/kg家蠅抗菌肽，WGR得到顯著提高。可見，飼料中添加適量的抗菌肽對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物均具有促生長(zhǎng)作用。關(guān)于AMI對(duì)吉富羅非魚的促生長(zhǎng)機(jī)理尚不明確，可能與其他抗菌肽類似，通過以下途徑提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能：①通過作用靶點(diǎn)，即嗜水氣單胞菌和大腸桿菌等有害菌的細(xì)胞膜上穿孔形成孔道使其通透性變大，造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞引起細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，使靶細(xì)胞死亡而達(dá)到抑菌的效果[17-19]，從而調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道菌群的平衡，改善腸道內(nèi)環(huán)境；②通過增加改善腸道生理結(jié)構(gòu)，從而直接或間接提高腸道消化酶活性[20-21]，腸道消化酶活性的提高可以增強(qiáng)動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用[22]；③通過受體依賴機(jī)制刺激先天性免疫細(xì)胞釋放趨化因子和細(xì)胞因子而發(fā)揮間接趨化作用，調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞數(shù)目，改善機(jī)體的免疫性能和抗病力來促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)[23-24]。

魚類消化酶活性不僅反映基本的消化生理特征，而且可以作為衡量魚類對(duì)飼料營(yíng)養(yǎng)成分消化、吸收和利用的重要指標(biāo)[25]，消化酶活性升高有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在體內(nèi)的消化、吸收和利用[26]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著飼料中AMI添加水平的升高，低劑量AMI即可顯著提高腸道脂肪酶水平，而高劑量的AMI對(duì)腸道脂肪酶活性與低劑量相比無顯著影響，腸道蛋白酶活性則隨著添加量的升高而升高，說明低劑量AMI促進(jìn)腸道對(duì)脂類的吸收，而高劑量AMI對(duì)蛋白質(zhì)類的促進(jìn)作用更為明顯。抗菌肽類物質(zhì)提高魚類消化酶活性的機(jī)理可能與其對(duì)消化道的生長(zhǎng)發(fā)育的促進(jìn)作用及其具有的廣譜抗菌活性有關(guān)，研究表明，抗菌肽能促進(jìn)腸道的發(fā)育，增加腸道成熟細(xì)胞數(shù)量及腸絨毛高度，而腸道成熟細(xì)胞數(shù)量與腸道消化酶活性成正相關(guān)，腸道成熟細(xì)胞增加能提高消化酶活性[20-21]；并且抗菌肽具有廣譜抗菌活性，可以促進(jìn)腸道有益菌群增殖，抑制有害菌群的增殖，調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡[27]，間接提高腸道消化酶活性[28]。

4 結(jié)論

飼料中添加AMI可提高吉富羅非魚的生長(zhǎng)性能和腸道消化酶活性，本試驗(yàn)條件下AMI最適添加量為50 mg/kg。