復(fù)方中藥對(duì)熱應(yīng)激蛋雞肝臟、空腸和卵巢HSP70表達(dá)量的影響

■韓喜彬 謝建中 巴彩鳳

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州121001；2.遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，遼寧錦州121001）

夏季高溫會(huì)導(dǎo)致熱應(yīng)激的發(fā)生，致使蛋雞生產(chǎn)性能下降，因此，抗熱應(yīng)激添加劑的研究備受關(guān)注，并取得了一系列成果，如維生素C、復(fù)合電解多維等。近年來，中草藥的研發(fā)與使用受到更多關(guān)注，中草藥抗熱應(yīng)激添加劑成為研究的熱點(diǎn)。相關(guān)研究表明，中草藥添加劑可以提高熱應(yīng)激蛋雞的采食量、產(chǎn)蛋率，降低料重比，并能提高機(jī)體免疫力等[1]，其抗熱應(yīng)激機(jī)制一般認(rèn)為與調(diào)節(jié)機(jī)體酸堿平衡、甲狀腺激素分泌以及超氧化物歧化酶（SOD）活性等有關(guān)[2]。本試驗(yàn)通過研究中藥復(fù)方對(duì)熱應(yīng)激蛋雞的肝臟、卵巢和空腸HSP70基因表達(dá)的影響，初步探討了所選中藥復(fù)方的分子調(diào)控機(jī)制，為中草藥添加劑開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用60周齡海蘭褐蛋雞80只，隨機(jī)分為4組，每組20只,即空白對(duì)照組、試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅲ組。根據(jù)產(chǎn)蛋期營(yíng)養(yǎng)需要配制基礎(chǔ)日糧，常規(guī)飼喂和飲水，預(yù)試期1周，正式試驗(yàn)期40 d，慢性熱應(yīng)激條件為：平均溫度31～32℃、平均相對(duì)濕度75%～80%。

1.2 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)儀器

黃芪、人參、白術(shù)、茯苓和甘草65℃烘干2 h,按1∶1∶1∶1∶0.5比例配合，混合均勻后粉碎，經(jīng)200目篩制得干粉，分裝備用?？瞻讓?duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1，試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅲ組在基礎(chǔ)日糧中分別添加0.5%、1.0%、1.5%中藥干粉。中草藥均購(gòu)自錦州遼西國(guó)藥大眾藥房。試驗(yàn)所用儀器包括酶標(biāo)儀680 ELX-800型（美國(guó)伯樂）、電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)DY89-Ⅱ型（廣州深華）、離心機(jī)TG16W型（長(zhǎng)沙湘智）、分光光度計(jì)UV-1500型（上海美析）。

1.3 HSP70表達(dá)檢測(cè)

在正式試驗(yàn)第7、10、20、30、40 d每組隨機(jī)抽取2只雞，剖殺取出肝臟、卵巢和空腸，各稱取0.5 g，液氮快速冷凍，研磨，加入10倍的0.9%冷生理鹽水，電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)破碎組織細(xì)胞，3 200 r/min離心5 min，取上清液用雞HSP70定量試劑盒測(cè)定含量（上海酶聯(lián)生物），具體步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方中藥對(duì)蛋雞肝臟HSP70表達(dá)的影響(見表2)

表2 復(fù)方中藥對(duì)蛋雞肝臟HSP70表達(dá)的影響(ng/ml)

由表2可見，各組蛋雞肝臟HSP70蛋白含量在第7、10、40 d存在顯著差異（P＜0.05），在第20、30 d差異不顯著（P＞0.05）；對(duì)照組（熱應(yīng)激組）蛋雞肝臟HSP70蛋白含量隨時(shí)間變化持續(xù)升高，試驗(yàn)組無明顯變化規(guī)律，但HSP70蛋白含量均在第10 d達(dá)到最高；各試驗(yàn)組HSP70蛋白含量在第7、10 d高于對(duì)照組，在第20、30、40 d低于對(duì)照組；3個(gè)試驗(yàn)組間差異均不顯著（P＞0.05），即中草藥添加劑量與蛋雞肝臟HSP70表達(dá)量間無相關(guān)性。

2.2 復(fù)方中藥對(duì)蛋雞卵巢HSP70表達(dá)的影響(見表3)

表3 復(fù)方中藥對(duì)蛋雞卵巢HSP70表達(dá)的影響(ng/ml)

由表3可見，各組蛋雞卵巢HSP70蛋白含量在第7、10、40 d存在顯著差異（P＜0.05），在第20、30 d差異不顯著（P＞0.05）；對(duì)照組蛋雞卵巢HSP70蛋白含量隨時(shí)間變化先降低后持續(xù)升高，試驗(yàn)組表現(xiàn)為先升后降，在第10 d達(dá)到最高；試驗(yàn)組HSP70蛋白含量在第7、10、20 d均高于對(duì)照組，在第30、40 d低于對(duì)照組；3個(gè)試驗(yàn)組間差異不顯著（P＞0.05），即中草藥添加劑量與蛋雞卵巢HSP70表達(dá)量間無相關(guān)性。

2.3 復(fù)方中藥對(duì)蛋雞空腸HSP70表達(dá)的影響(見表4)

表4 復(fù)方中藥對(duì)蛋雞空腸HSP70表達(dá)的影響(ng/ml)

由表4可見，試驗(yàn)Ⅲ組蛋雞空腸HSP70蛋白含量在第20 d顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，在其余時(shí)間差異均不顯著(P＞0.05)；對(duì)照組蛋雞空腸HSP70蛋白含量隨時(shí)間變化持續(xù)升高，試驗(yàn)組表現(xiàn)為先升高后降低，在第20 d達(dá)到最高；試驗(yàn)組HSP70蛋白含量在第10、20 d高于對(duì)照組，在第30、40 d低于對(duì)照組；3個(gè)試驗(yàn)組組間差異不顯著（P＞0.05），即中草藥添加劑量與蛋雞空腸HSP70表達(dá)量間無相關(guān)性。

3 討論

根據(jù)近年報(bào)道顯示，HSP70主要通過三方面增強(qiáng)機(jī)體熱耐受性：①分子伴侶作用，特別是對(duì)蛋白質(zhì)分子的折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)、寡聚體的形成和解聚等，可以維持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，在不利條件下，提高細(xì)胞的抵抗力，起到應(yīng)激保護(hù)作用[3]；②抗氧化作用，可以提高血清SOD、GSH-Px活性，同時(shí)降低MDA含量，緩解過氧化過程的發(fā)生[4]；③免疫協(xié)同作用，可以作為抗原肽的載體，通過其表面的肽結(jié)合位點(diǎn)與肽段結(jié)合增強(qiáng)后者的抗原性，發(fā)揮抗原提呈作用[5]。由于HSP70保護(hù)作用得到證實(shí)，如何通過飼養(yǎng)手段提高HSP70的表達(dá)量已成為當(dāng)今畜禽抗應(yīng)激研究的熱點(diǎn)，但肖敏華等[6]、祁延澤[7]認(rèn)為，HSP70的保護(hù)作用有限，當(dāng)應(yīng)激時(shí)間過長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡后溢出的HSP70會(huì)破壞其他細(xì)胞膜的完整性，使機(jī)體受損進(jìn)程加快。本研究結(jié)果顯示，中藥組蛋雞肝臟HSP70表達(dá)量在試驗(yàn)初期存在高于對(duì)照組（熱應(yīng)激組）（P＜0.05或P＞0.05）的情況，空腸表達(dá)量在中期存在高于對(duì)照組（P＜0.05或P＞0.05）的情況，對(duì)照組(熱應(yīng)激組)的各指標(biāo)表達(dá)量在整個(gè)試驗(yàn)期持續(xù)升高，而試驗(yàn)組經(jīng)過高峰期后在中草藥調(diào)節(jié)下HSP70表達(dá)量下降，說明復(fù)方中藥具有雙向調(diào)節(jié)作用，在應(yīng)激初期誘導(dǎo)機(jī)體高表達(dá)HSP70，對(duì)機(jī)體細(xì)胞形成保護(hù)，減輕胞核損傷，增強(qiáng)機(jī)體熱抵抗力，而隨著熱應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)，中草藥可以抑制HSP70的表達(dá)，以防止過表達(dá)造成的傷害，HSP70表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化說明細(xì)胞的熱適應(yīng)過程。上述研究結(jié)果與鐘翠紅等[8]、毛帥等[9]的研究結(jié)果相似，中草藥抗熱效應(yīng)屬于多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)，包括提供免疫器官指數(shù)，增強(qiáng)免疫功能，調(diào)節(jié)體液平衡等，而中草藥對(duì)HSP70表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

所選中藥復(fù)方在蛋雞慢性熱應(yīng)激初、中期可以促使肝臟、卵巢和空腸HSP70表達(dá)量升高，提高機(jī)體耐熱和抗損傷能力，在熱應(yīng)激后期可誘導(dǎo)HSP70表達(dá)量下降，防止過表達(dá)造成的進(jìn)一步傷害。