枯草芽孢桿菌甘露聚糖酶基因優(yōu)化及表達(dá)

■聶金梅 李陽(yáng)源 鐘開(kāi)新

（廣東溢多利生物科技股份有限公司，廣東珠海519060）

本研究首次采用去除基因信號(hào)肽、定點(diǎn)突變、重疊PCR等方法克隆得到來(lái)源于枯草芽孢桿菌的中性甘露聚糖酶基因，采用基因工程手段構(gòu)建篩選得到一株高效分泌表達(dá)甘露聚糖酶的畢赤酵母工程菌株；初步研究了該甘露聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)，為將枯草芽孢桿菌甘露聚糖酶用作工業(yè)用酶提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌Top10、畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞X33、pPICZαA均為本實(shí)驗(yàn)室保存。菌株(Bacillus subtilis編號(hào)GIM 1.259)購(gòu)自廣東省微生物研究所菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB、LBZ、BMGY培養(yǎng)基參見(jiàn)Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊(cè)。

1.1.3 試劑

SacI購(gòu)自Fermentas公司，其它限制酶、DNA聚合酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 設(shè)計(jì)引物

根據(jù)甘露聚糖酶全基因序列，設(shè)計(jì)引物WBmanF/WBmanR;WBman mutF/WBman mutR，引物序列設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 研究所用引物序列

1.2.2 測(cè)定甘露聚糖酶活性方法

吸取2.00 ml經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的酶液，37℃平衡10 min，加入2.0 ml槐豆膠溶液（0.5%），37℃平衡10 min，加入到50 ml比色管中，再加入5 mlDNS試劑，電磁振蕩3 s，以終止酶解反應(yīng)。沸水浴加熱5 min，用自來(lái)水冷卻至室溫，加水定容至25 ml，電磁振蕩3 s。以標(biāo)準(zhǔn)空白樣為對(duì)照，在540 nm處測(cè)定吸光度值。酶活性定義：在37℃、pH值5.5條件下，1 min從濃度為1 mg/ml的甘露聚糖溶液中降解釋放1 μmol還原糖所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位。

1.2.3 提取枯草芽孢桿菌基因組

枯草芽孢桿菌干粉于營(yíng)養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基中復(fù)壯2 d，30℃，靜置培養(yǎng)，此為第一代G1；劃線(xiàn)于LB培養(yǎng)基，長(zhǎng)出單菌落，此為第二代G2；將G2代單菌落制成懸液，制備甘油冷凍管G2；挑取單菌落轉(zhuǎn)接斜面菌種，此為工作用菌種G3；制成懸液G3，提取枯草芽孢桿菌基因組，置于-20℃保存。

1.2.4 克隆甘露聚糖酶基因

用枯草芽孢桿菌基因組為模板、引物WBmanF/WBmanR，通過(guò)PCR方法克隆甘露聚糖酶編碼序列（WBMAN），經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，切膠回收約1.1 kb的片段。

1.2.5 定點(diǎn)突變法和重疊PCR法

設(shè)計(jì)一對(duì)突變引物WBman mutF/WBman mutR，采用重疊PCR方法擴(kuò)增其編碼區(qū)基因序列。重疊PCR分四步進(jìn)行，分別為PCR1、PCR2、PCR3和PCR4，PCR3反應(yīng)體系是以PCR1和PCR2作模板兼做引物進(jìn)行擴(kuò)增，共18個(gè)循環(huán)；其余PCR擴(kuò)增體系見(jiàn)表2，PCR反應(yīng)條件見(jiàn)表3。

表2 PCR擴(kuò)增體系

表3 PCR反應(yīng)條件

將PCR1和PCR2產(chǎn)物用1%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，分別切膠回收大小約為0.5 kb和0.6 kb的基因片段并純化，置于-20℃保存，具體操作參照PCR純化試劑盒。以上述PCR1和PCR2產(chǎn)物片段為模板和引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR3共18個(gè)循環(huán)；以PCR3產(chǎn)物為模板，以WBmanF及WBmanR為引物，進(jìn)行PCR4擴(kuò)增，將PCR4產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，并切膠回收大小約1.1 kb基因片段，置于-20℃保存。取5 μl純化后的DNA進(jìn)行瓊脂糖電泳分析。

1.2.6 體外構(gòu)建重組質(zhì)粒V-pPIC-WBmanmut

取甘露聚糖酶突變基因 WBmanmut以及pPICZαA各20 μl，用Not1和EcoR1雙酶切（37 ℃、3 h），T4連接酶連接（4℃過(guò)夜），轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，轉(zhuǎn)化步驟如下：冰上放置30 min，42℃孵育90 s，冰上放置20 min，加1 mlLB培養(yǎng)基后37℃振蕩培養(yǎng)1 h，涂布LBZ平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單菌落共20個(gè)，采用菌落PCR法鑒定陽(yáng)性克隆子，菌落PCR反應(yīng)條件：94℃、4 min；94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、2 min，72 ℃、10 min，30個(gè)循環(huán)。取10 μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行酶切鑒定以及測(cè)序序列，DNA測(cè)序由深圳華大基因公司完成。

1.2.7 構(gòu)建重組工程菌株

將重組質(zhì)粒V-pPIC-WBmanmut用DpnI線(xiàn)性化，采用電擊法將線(xiàn)性化的V-pPIC-WBmanmut轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X33，涂布于YPDZ平板，30℃下靜置培養(yǎng)2～3 d，直至長(zhǎng)出單菌落。

1.2.8 篩選高效分泌表達(dá)的葡萄糖氧化酶畢赤酵母工程菌株

挑取單菌落接種于裝有5 mlBMGY的50 ml離心管中，于28～30 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600nm為2～6時(shí)，添加甲醇至終溶度為0.6%，每隔24 h補(bǔ)加甲醇并留樣，采用測(cè)定酶活性的方法初步篩選高產(chǎn)菌株，再以1%的量接種至裝有50 mlBMGY的500 ml三角瓶中，用雙層紗布封口，于28～30℃、200 r/min的搖床培養(yǎng)，復(fù)篩得到一株高效分泌表達(dá)的甘露聚糖酶突變基因工程菌株，將它命名為V-X33-pPIC-WBmanmut。離心收集搖瓶發(fā)酵上清液，進(jìn)行枯草芽孢桿菌甘露聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)研究。

2 結(jié)果

2.1 甘露聚糖酶基因的克隆

以枯草芽孢桿菌基因組為模板，PCR擴(kuò)增得到甘露聚糖酶基因，切膠純化目的片段（約1 100 bp）（見(jiàn)圖1）。測(cè)序分析由深圳華大基因公司完成,結(jié)果表明甘露聚糖酶基因大小為1 104 bp，編碼362個(gè)氨基酸。該基因與GenBank中已登錄的同類(lèi)基因（NC_014976.1）的氨基酸序列具有95%以上的同源性。

2.2 含甘露聚糖酶基因的畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒wbman-pic的構(gòu)建

PCR4產(chǎn)物加入Taq酶擴(kuò)增5個(gè)循環(huán)，在甘露聚糖酶基因3'端連接polyA尾部結(jié)構(gòu)，再與PMD20-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Top10，LBZ平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，挑取單菌落進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證（見(jiàn)圖2），提取質(zhì)粒,將稀釋1 000倍的質(zhì)粒作為模板，重疊PCR法擴(kuò)增含突變位點(diǎn)的甘露聚糖酶基因，切膠純化目的片段(見(jiàn)圖3)；提取質(zhì)粒，用EcoRI和NotI將重組突變甘露聚糖酶質(zhì)粒和pPICZαA進(jìn)行酶切，用PCR純化試劑盒純化，T4連接酶連接（4℃過(guò)夜），轉(zhuǎn)化至Top10細(xì)胞，LBZ平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，菌液PCR驗(yàn)證后（見(jiàn)圖4），提取質(zhì)粒，用EcoRI和NotI酶切質(zhì)粒應(yīng)得到1.1kb目的基因條帶和3.6 kb載體pPICZαA的基因條帶，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖5所示。

圖1 枯草芽孢桿菌基因組擴(kuò)增甘露聚糖酶產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

圖2 重組質(zhì)粒甘露聚糖酶PMD20-T PCR鑒定

圖3 枯草芽孢桿菌突變甘露聚糖酶基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

圖4 突變型甘露聚糖酶重組質(zhì)粒PCR鑒定

圖5 突變型甘露聚糖酶重組質(zhì)粒酶切分析

2.3 甘露聚糖酶基因的分泌表達(dá)

用Dpn1酶切突變型甘露聚糖酶重組質(zhì)粒，柱式純化，將線(xiàn)性化的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入畢赤酵母X33感受態(tài)細(xì)胞中，YPDZ平板篩選陽(yáng)性表達(dá)載體。從140個(gè)單菌落中篩選出一株酶活力最高的工程菌株，接種至搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)48 h后，產(chǎn)酶活性為120 U/ml。

2.4 枯草芽孢桿菌甘露聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

2.4.1 溫度對(duì)重組β-甘露聚糖酶的影響

在 pH 值 6.0的條件下，分別在 30、40、50、60、70℃，用DNS法測(cè)定重組β-甘露聚糖酶的酶活力，結(jié)果表明，在40℃時(shí)測(cè)定的酶活力最高（見(jiàn)圖6）。

為了研究重組甘露聚糖酶在不同溫度下的穩(wěn)定性，分別將上清液在30、40、45、50、55、60、65、70 ℃ 靜置5 min，然后在40℃、pH值6.0的條件下用DNS法測(cè)定酶的殘存活力，以40℃所測(cè)得的酶活力為100%，結(jié)果顯示，當(dāng)溫度達(dá)到70℃時(shí)，剩余酶活力仍保留48%（見(jiàn)圖7）。

2.4.2 pH值對(duì)重組β-甘露聚糖酶的影響

在40 ℃條件下,分別在pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0時(shí),用DNS法測(cè)定重組β-甘露聚糖酶的酶活力,結(jié)果顯示，當(dāng)pH值為6.0時(shí)，酶的催化活力最高，以40℃、pH值6.0時(shí)酶的催化活力為100%，pH值5.0～8.0時(shí)相對(duì)催化活力均在最適催化活力的80%以上(見(jiàn)圖8)。

圖6 甘露聚糖酶的最適催化溫度

圖7 甘露聚糖酶的耐溫性能

圖8 甘露聚糖酶的最適催化pH值

為了研究重組β-甘露聚糖酶在不同pH值條件下的穩(wěn)定性，分別將酶液在pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0的緩沖液中，置于4℃靜置4 h，然后在40℃、pH值6.0條件下，用DNS法測(cè)定甘露聚糖酶的殘存活力，以pH值為6.0時(shí)測(cè)得的酶活力為100%，結(jié)果表明，pH值在6.0～8.0范圍內(nèi)，剩余酶活力均保留50%以上，具有較好的耐堿性（見(jiàn)圖9）。

2.4.3 金屬離子對(duì)重組β-甘露聚糖酶的影響

在酶上清液中分別加入終濃度為10 mM的Na+、Fe3+、Cu2+、Li+、Mg2+、Ca2+、K+、Mn2+、Fe2+、Zn2+、Co2+、EDTA，室溫靜置20 min后測(cè)定酶的殘余酶活力。以不添加任何離子的酶上清液作對(duì)照，所測(cè)定的酶活力為100%。其它各組所測(cè)定的酶活力結(jié)果見(jiàn)圖10，各種離子對(duì)重組β-甘露聚糖酶的影響各不相同，但均保持59%以上的酶活。

圖9 甘露聚糖酶的耐酸堿性能

圖10 金屬離子以及EDTA對(duì)甘露聚糖酶活性的影響

3 討論

3.1 不同來(lái)源的甘露聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)（見(jiàn)表4）

甘露聚糖酶普遍存在于動(dòng)物、植物和微生物中，其中微生物是甘露聚糖酶的主要來(lái)源，包括細(xì)菌、真菌和放線(xiàn)菌等。其中細(xì)菌包括芽孢桿菌[1]、假單胞菌，真菌中的曲霉菌[2]、里氏木霉菌[3]以及放線(xiàn)菌中的鏈霉菌[4]、酵母[5]等。已發(fā)現(xiàn)100余種來(lái)源于微生物的甘露聚糖酶，在實(shí)際生產(chǎn)和基礎(chǔ)研究中已得到了廣泛應(yīng)用，它具有活性高、成本低、提取方便等優(yōu)點(diǎn)。來(lái)源于不同微生物的甘露聚糖酶性質(zhì)存在一定差異，細(xì)菌來(lái)源的多屬于中性酶，真菌來(lái)源的多為酸性酶。

表4 部分微生物產(chǎn)β-甘露聚糖酶及其酶學(xué)特性

3.2 甘露聚糖酶的應(yīng)用

3.2.1 甘露聚糖酶在飼料工業(yè)中的應(yīng)用

甘露聚糖酶可降解β-D-甘露聚糖、破壞植物性飼料細(xì)胞壁，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)與消化酶充分接觸，提高動(dòng)物內(nèi)源酶(如胰蛋白酶、淀粉酶等)的活性，消除抗?fàn)I養(yǎng)因子的作用，降低動(dòng)物消化道內(nèi)容物黏稠度，改善腸道微生物環(huán)境，改善動(dòng)物的健康狀況，促進(jìn)生長(zhǎng)，減少糞便排泄，減輕環(huán)境污染。

3.2.2 甘露聚糖酶用作工具酶

在復(fù)雜多糖中常常有β-甘露糖苷鍵存在，作為工具酶添加β-甘露聚糖酶將其切除，再測(cè)定水解產(chǎn)物中各組分的含量和類(lèi)型，進(jìn)一步進(jìn)行分析便可推測(cè)多糖物質(zhì)可能的結(jié)構(gòu)。

此外，β-甘露聚糖酶可用于食品的加工貯藏和果汁澄清，是一種優(yōu)質(zhì)的食品添加劑。也可應(yīng)用于紙漿的漂白工藝、洗滌工業(yè)以及紡織工業(yè)，還可用作油井石油壓裂液的優(yōu)質(zhì)生物破膠劑，具有高效、價(jià)廉、適用范圍廣且對(duì)地層傷害小等優(yōu)點(diǎn)。

4 結(jié)論

本研究從枯草芽孢桿菌基因組中克隆出中性甘露聚糖酶基因，采用定點(diǎn)突變、重疊PCR酶切和連接等方法，體外構(gòu)建重組表達(dá)載體，利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)高效穩(wěn)定地表達(dá)甘露聚糖酶，最適作用溫度和pH值分別是40℃和6.0，搖瓶培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)48 h后產(chǎn)酶活性為120 U/ml，為枯草芽孢桿菌甘露聚糖酶的應(yīng)用提供參考。