超高效液相色譜-二極管陣列檢測器法快速測定保健食品中違法添加的14種性功能藥物

林 芳，李 濤*，耿慶光，劉海靜，朱小紅，王 松

（陜西省食品藥品檢驗所，陜西 西安 710061）

超高效液相色譜-二極管陣列檢測器法快速測定保健食品中違法添加的14種性功能藥物

林 芳，李 濤*，耿慶光，劉海靜，朱小紅，王 松

（陜西省食品藥品檢驗所，陜西 西安 710061）

建立超高效液相色譜-二極管陣列檢測器檢測方法同時、快速測定抗疲勞類及增強免疫力類保健食品中違法添加的14種性功能類化學(xué)藥物（那紅地那非、紅地那非、伐地那非、羥基豪莫西地那非、枸櫞酸西地那非、豪莫西地那非、氨基他達(dá)拉非、他達(dá)拉非、硫代艾地那非、偽伐地那非、那莫西地那非、康力龍、丙酸睪酮、苯丙酸諾龍）。采用ZORBAX SB-C18色譜柱，流動相A：乙腈-甲醇（90∶10，V/V），B：0.7%三乙胺溶液（pH 2.8），梯度洗脫，流速0.35 mL/min。采集230 nm波長處的色譜圖進(jìn)行初篩和定量。根據(jù)14種藥物的光譜特征建立光譜庫，確證檢出化合物。結(jié)果表明：14種性功能藥物在15.0 min內(nèi)可有效分離，在8～80 μg/mL的線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均大于0.999 5，平均回收率為90.1%～106.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.7%～4.9%，檢測限為2～3 ng。該方法簡便、快速、靈敏度高且重復(fù)性好，可作為檢測抗疲勞類及增強免疫力類保健食品中違法添加化學(xué)藥物的快速測定方法。

保健食品；性功能藥物；違法添加；快速測定；超高效液相色譜-二極管陣列檢測器

近年來，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和生活節(jié)奏的加快，越來越多的人出現(xiàn)易疲勞、免疫力低下等問題，長期處于亞健康狀態(tài)。保健食品作為一種新興的功能性食品，常宣稱含有天然、有機、中草藥成分，具備免疫調(diào)節(jié)等功能，擁有越來越廣泛的服用人群。同時，一些不法商家為了增加療效、牟取暴利，在部分抗疲勞、增強免疫力產(chǎn)品中添加了可促進(jìn)療效的性功能化學(xué)藥物。這類藥物，如長期使用不當(dāng)，將對人體造成極大的危害[1-3]。2012年12月14日，國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布了《保健食品中可能非法添加的物質(zhì)名單（第一批）》[4]，列出聲稱可緩解體力疲勞（抗疲勞）、增強免疫力（調(diào)節(jié)免疫）的功能產(chǎn)品中可能添加的那紅地那非、紅地那非、伐地那非等11種磷酸二酯酶5型抑制劑（phosphodiesterase type 5 inhibitor，PDE5），同時公布了檢測依據(jù)[5-6]。這2種方法均采用高效液相色譜法，分別檢測紅地那非、他達(dá)拉非等7種和11種非法添加成分，每次樣品的儀器檢測時間在40～60 min，對試劑、耗材的損耗均較大，并且標(biāo)準(zhǔn)中有個別成分分離效果欠佳，受色譜柱和儀器等諸多因素的影響，很難重現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)中個別成分的分離效果。如果能夠快速、有效地檢測該類違法添加成分，將對加強市場監(jiān)管和保障人民群眾健康起到積極的作用。

與傳統(tǒng)的高效液相色譜相比，超高效液相色譜具有更快的分離速率、更高的分辨率和靈敏度，可適用于復(fù)雜基質(zhì)中藥物的分離、分析[7-9]。本實驗利用超高效液相色譜的高分辨率和高靈敏度等特性，建立了一種同時、快速檢測那紅地那非、紅地那非、伐地那非、羥基豪莫西地那非、枸櫞酸西地那非、豪莫西地那非、氨基他達(dá)拉非、他達(dá)拉非、硫代艾地那非、偽伐地那非、那莫西地那非、康力龍、丙酸睪酮、苯丙酸諾龍共14種性功能類化學(xué)藥物的方法。該方法結(jié)合二極管陣列檢測器的光譜特征分析，可在一次運行中同時完成樣品快速篩查、光譜確證和定量分析，線性關(guān)系、回收率、分離度均良好，檢測簡便、快速、靈敏度高且重復(fù)性好。14種性功能類藥物不僅覆蓋了國家食品藥品監(jiān)督管理局最新公布的品種，還根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[10-14]增加了3種可能用于違禁添加的激素藥物，該方法可作為抗疲勞及增強免疫力的保健食品中違法添加性功能類化學(xué)藥物的快速篩查方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

檢測樣品為2012年全國保健食品風(fēng)險監(jiān)測工作中，從陜西省11個市（區(qū)）抽查到的聲稱具有抗疲勞和增強免疫力功能的保健食品，共計171批（每一批次為同一品種3～5盒）。

對照品：枸櫞酸西地那非、他達(dá)拉非、丙酸睪酮、苯丙酸諾龍（99.3%） 中國食品藥品檢定研究院；伐地那非（99.5%）、康力龍（99.5%） 德國Dr. Ehrenstorfer公司；那紅地那非（99.9%）、紅地那非（99.1%）、羥基豪莫西地那非（98.8%）、豪莫西地那非（98.7%）、氨基他達(dá)拉非（99.9%）、硫代艾地那非（99.7%）、偽伐地那非（99.5%）、那莫西地那非（99.7%） 加拿大TLC Pharma Chem公司。

甲醇、乙腈、三乙胺（HPLC級） 美國Tedia公司；磷酸（分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1290 infinity超高效液相色譜儀（配有1290二極管陣列檢測器） 美國Agilent公司；2695-Quattro Micro API三重四極桿液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Waters公司；AE-240雙量程電子天平 瑞士Mettlor Toledo公司；Rotavapor R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Büchi公司；AS20500B超聲波清洗器 天津奧特賽恩斯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜及光譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫30℃；流速0.35 mL/min；進(jìn)樣量1 μL。分別以乙睛-0.7%三乙胺溶液（用磷酸調(diào)至pH 2.8）、甲醇-0.7%三乙胺溶液（pH 2.8）、乙腈＋甲醇混合液-0.7%三乙胺溶液（pH 2.8）梯度洗脫，用含14種藥物的低濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液優(yōu)化最佳分離條件。梯度洗脫（洗脫條件見表1）；檢測波長230 nm。

光譜范圍190～400 nm；光譜步進(jìn)值1.0 nm；光譜采集模式：全部。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Conditions of gradient elution

1.3.2 對照品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取1.1節(jié)所述14種對照品各20.0 mg，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得單標(biāo)儲備液，質(zhì)量濃度約為2 mg/mL。再從各單標(biāo)儲備液中準(zhǔn)確移取1.0 mL，置于同一25 mL容量瓶中，為消除樣品基質(zhì)的影響，采用陰性樣品甲醇提取液（參照1.3.3節(jié)處理方法）定容至刻度，得混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，質(zhì)量濃度約80 ?g/mL。再用陰性樣品甲醇提取液將混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液梯度稀釋成標(biāo)準(zhǔn)曲線各系列質(zhì)量濃度，得14種性功能藥物的系列混合標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，質(zhì)量濃度為8～80 ?g/mL。由于抗疲勞類及增強免疫力類保健食品制劑配方的多樣性，本步驟所用的陰性樣品為歷次抽檢中有代表性的固體樣品，輔料成分為硬脂酸鎂、乳糖、預(yù)膠化淀粉等，經(jīng)檢測不含14種性功能藥物。

1.3.3 樣品前處理

取1.1節(jié)所述來源樣品，參考文獻(xiàn)[6,15-20]進(jìn)行樣品前處理。

固體樣品：取樣品5次口服劑量（片劑除去包衣，膠囊劑取內(nèi)容物），研細(xì)，精密稱取1次服用量，置50 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲處理20 min，冷卻，加甲醇定容至刻度，搖勻，過濾，取濾液作為供試品溶液。

液體樣品：準(zhǔn)確移取相當(dāng)于1次口服劑量的溶液，60℃旋蒸至近干，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，取濾液作為供試品溶液。同批樣品均做2份平行樣，供試品溶液若檢出藥物含量過高，可根據(jù)具體情況再進(jìn)行稀釋。

1.3.4 方法的穩(wěn)定性及重復(fù)性

取混合標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液分別在0、12、24、48、72 h進(jìn)樣，計算14種性功能藥物峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。同時，選取檢出的陽性樣品，按1.3.3節(jié)方法處理，分別在0、12、24、48、72 h相同條件進(jìn)樣，計算檢出樣品對應(yīng)藥物含量的RSD，考察方法的穩(wěn)定性。

取同批次陽性樣品6份，按1.3.3節(jié)方法平行處理，得到供試品溶液并測定。以檢出藥物峰面積的RSD考察方法的重復(fù)性。

1.3.5 回收率和精密度

分別選取固體（片劑）和液體（口服液）基質(zhì)的空白樣品。加入適量的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，使加標(biāo)質(zhì)量濃度達(dá)到線性最低點質(zhì)量濃度、2倍線性最低點質(zhì)量濃度、4倍線性最低點質(zhì)量濃度3個添加水平。按1.3.3節(jié)中的方法進(jìn)行處理，每種基質(zhì)的每個添加水平平行做3份樣，每個樣品重復(fù)測定2次，計算樣品的回收率及精密度。

1.3.6 光譜確證分析

同時采集對照品和樣品在190～400 nm波長處的光譜，根據(jù)14種性功能藥物的特征吸收光譜建立光譜庫，當(dāng)檢測到樣品有與對照品保留時間一致的色譜峰時，即與該標(biāo)準(zhǔn)對照藥物進(jìn)行光譜匹配度檢索，匹配度達(dá)90%以上且峰純度較高（＞90%）時，可判斷該類保健食品中添加了某種性功能藥物（必要時可用質(zhì)譜進(jìn)行確證），同時可計算出該類藥物的添加量。

1.3.7 方法的驗證

為了驗證本方法的可靠性，以含有氨基他達(dá)拉非陽性樣品為例，進(jìn)行質(zhì)譜確證[6,21-25]。

質(zhì)譜條件：電噴射離子源；正離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測模式；電離電壓3.0kV；錐孔電壓25V；源溫度120°C；脫溶劑氣溫度380°C；碰撞氣：氬氣3.0×10-3mbar；脫溶劑氣流速800L/h；錐孔氣流速50L/h。氨基他達(dá)拉非母離子（m/z）391；子離子（m/z）262，碰撞能量35eV；子離子（m/z）169，碰撞能量30eV；子離子（m/z）134.9，碰撞能量20eV。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

以ZORBAX SB-C18作為分析柱，以流動相A乙腈-甲醇（90∶10，V/V）、流動相B 0.7%三乙胺溶液（pH 2.8）進(jìn)行梯度洗脫，可使14種性功能藥物保持足夠的分離度和良好的峰形。經(jīng)相同色譜條件下的對照品單標(biāo)溶液定位，可確定14種藥物的出峰順序和保留時間；同時在230 nm波長處，檢測信號靈敏度較高，分離效果滿足檢測需要。此條件下梯度分析僅需15 min。14種性功能藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖1。乙腈-0.7%三乙胺溶液及甲醇-0.7%三乙胺溶液梯度洗脫，均不能有效分離這14種性功能藥物，色譜圖見圖2、3。

圖1 梯度洗脫混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖 （流動相A：乙腈-甲醇，流動相B：0.7%三乙胺溶液（pH 2.8）） .8Fig.1 Chromatogram of mixed standard solution with mobile phase A: acetonitrile-methanol, and mobile phase B：0.7% triethylamine (pH 2.8) by gradient elution

圖2 梯度洗脫混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（流動相為乙睛-0.7%三乙胺溶液（pH 2.8）) .8)Fig.2 Chromatogram of mixed standard solution with acetonitrile-0.7% triethylamine (pH 2.8) by gradient elution

圖3 梯度洗脫混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（流動相為甲醇-0.7%三乙胺溶液（pH 2.8）） .8Fig.3 Chromatogram of mixed standard solution with methanol-0.7% triethylamine (pH 2.8) by gradient elution

2.2 線性關(guān)系、定量限和檢測限

將1.3.2節(jié)中得到的14種性功能藥物的系列混合標(biāo)曲溶液，按優(yōu)化后的色譜條件進(jìn)行檢測，以對應(yīng)的色譜圖峰面積為縱坐標(biāo)（y）、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行回歸分析。結(jié)果表明，14種性功能藥物的質(zhì)量濃度與其峰面積在8～80 ?g/mL內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.999 5，說明本方法適用于保健食品中違法添加的14種性功能藥物的定量分析。

在本實驗條件下，將混合標(biāo)曲最低點質(zhì)量濃度乘以進(jìn)樣體積（1 μL）作為本方法的定量限，為8 ng。

在本實驗條件下，將混合標(biāo)曲溶液連續(xù)稀釋，以對應(yīng)質(zhì)量濃度的色譜峰響應(yīng)值大于3倍信噪比的質(zhì)量濃度（噪聲水平：6×SD=0.436 0 mAU）乘以進(jìn)樣體積（1 μL）得到本方法的檢測限，為2～3 ng（表2）。14種性功能藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、定量限、檢測限見表2。

表2 14種性功能藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、定量限、檢測限Table 2 Calibration curves, correlation coefficients ( ), linear ranges, limits of quantification (LOQs), limits of detection (LODs) of 14 aphrodisiacs drugs

2.3 穩(wěn)定性

按1.3.4節(jié)中的方法，計算14種性功能藥物峰面積的RSD，RSD在0.77%～2.96%。同時選取的陽性樣品，對應(yīng)藥物含量的RSD在1.58%～3.64%，說明對照品和樣品在72 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.4 重復(fù)性

按1.3.4節(jié)中的方法，檢出藥物峰面積的RSD最大為3.1%，說明本方法重復(fù)性良好。

2.5 回收率和精密度

按1.3.5節(jié)中的方法，14種性功能藥物在3個添加水平的固體基質(zhì)中回收率為91.6%～105.6%；液體基質(zhì)中的回收率為90.1%～106.5%，RSD均小于5%（表3）。

表3 14種性功能藥物在不同基質(zhì)的保健食品中的加標(biāo)回收率和精密度（n==66）Table 3 Recoveries and precision (RSD) of 14 aphrodisiac drugs spiked in different health food matrices (n == 66))

2.6 光譜確證分析

按1.3.6節(jié)中的方法進(jìn)行光譜確證分析，圖4為14種性功能藥物的光譜庫。

圖4 14種性功能藥物的特征吸收光譜庫Fig.4 Characteristic absorption spectral library of 14 aphrodisiac drugs

2.7 樣品的測定

圖5 氨基他達(dá)拉非陽性樣品色譜圖（t=4.582 min）Fig.5 Chromatogram of amino tadalafil-positive sample

圖6 氨基他達(dá)拉菲對照品（a）與檢出陽性樣品（b）光譜對比圖Fig.6 Comparison spectrua of amino tadalafil standard and positive sample

取1.1節(jié)中所述樣品，按照1.3.3節(jié)中所述方法進(jìn)行提取，并按優(yōu)化后的色譜條件進(jìn)行檢測。共檢出非法添加樣品11批，某陽性樣品色譜圖如圖5所示，檢出的添加物與氨基他達(dá)拉非保留時間一致，且與氨基他達(dá)拉菲對照品光譜匹配度達(dá)99%，確定為樣品添加有氨基他達(dá)拉非。光譜對比見圖6。

按1.3.7節(jié)方法，驗證本方法的可靠性，樣品中母離子和3對子離子均有檢出，離子豐度比符合要求，再次確認(rèn)檢出物為氨基他達(dá)拉非。多反應(yīng)監(jiān)測模式樣品圖譜見圖7。

圖7 陽性樣品多反應(yīng)監(jiān)測模式圖譜Fig.7 MRM chromatogram of amino tadalafil-positive sample

3 結(jié) 論

本研究建立了UPLC-DAD檢測法，可同時、快速測定抗疲勞及增強免疫力類保健食品中非法添加的14種性功能藥物。該方法實現(xiàn)了對14種性功能藥物的同時、有效分離，分離效果優(yōu)于目前國家食品藥品監(jiān)督管理局推薦標(biāo)準(zhǔn)[5-6]。該方法簡便、快速、靈敏度高、重復(fù)性好，并可同時采集光譜數(shù)據(jù)，使樣品初篩、光譜確證、含量測定同時完成，可用于市場監(jiān)管中抗疲勞和增強免疫力2類保健食品中違法添加物的快速檢測。

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Rapid Determination of 14 Illegally Added Aphrodisiac Drugs in Functional Foods by Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Photodiode Array Detector

LIN Fang, LI Tao*, GENG Qing-guang, LIU Hai-jing, ZHU Xiao-hong, WANG Song (Shaanxi Institute for Food and Drug Control, Xi’an 710061, China)

An ultra performance liquid chromatography-photodiode array detection method (UPLC-DAD) has been established for rapid and simultaneous determination of 14 illegally added aphrodisiacs (nor-acetylsildenafil, acetildenafil, vardenafil, hydroxyhomosildenafil, sildenafil citrate, homosildenafil, amino tadalafil, tadalafil, thioaildenafil, pseudovardenafil, norneosildenafil, stanozolol, testosterone propionate, and nandrolone phenylpropionate) in anti-fatigue and immunity promoting functional foods. ZORBAX SB-C18column was applied with mobile phase A consisting of acetonitrilemethanol (90:10, V/V) and phase B consisting of 0.7% triethylamine (pH 2.8). Linear gradient elution was used with a flow rate of 0.35 mL/min and detection wavelength of 230 nm for rapid screening and quantification of these drugs. Characteristic absorption spectral library of 14 aphrodisiac dru gs have been established for identifying them. The results showed that the 14 aphrodisiac drugs could be effectively separated within 15.0 min, and the standard curves had good linearity over the concentration range of 8–80 μg/mL. The correlation coefficients were all above 0.999 5. The average recoveries ranged from 90.1% to 106.5% with relative stand deviations (RSDs) of 0.7%–4.9%. The detection limits for the 14 aphrodisiacs drugs ranged from 2 to 3 ng. These results indicate that the method is simple and rapid with high sensitivity and good reproducibility, and suitable for the rapid and simultaneous determination of the 14 illegally added aphrodisiac drugs in antifatigue and immunity-improving health foods.

health food; aphrodisiacs drugs; illegally added; rapid determination; ultra performance liquid chromatographyphotodiode array detector (UPLC-DAD)

TS207.7；O657.72

A

1002-6630（2014）04-0163-07

10.7506/spkx1002-6630-201404034

2013-06-03

2014年陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃項目“陜西省食品藥品快速檢測公共服務(wù)平臺建設(shè)”項目；陜西省社會科學(xué)基金項目（13G020）

林芳（1982—），女，主管藥師，碩士，研究方向為食品、保健食品理化檢驗及安全性檢測。E-mail：fanqiehuayuan@126.com

*通信作者：李濤（1978—），男，副主任藥師，學(xué)士，研究方向為食品及保健食品檢驗。E-mail：westyx@126.com