固相萃取-高效液相色譜法檢測肉鴨表皮組織中的松香酸

張?zhí)K珍，耿志明，王道營，諸永志，劉 芳，張牧焓，卞 歡，徐為民,*

（1.江蘇省農業(yè)科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.南京農業(yè)大學 肉品加工與質量控制教育部重點實驗室，江蘇 南京 210095）

固相萃取-高效液相色譜法檢測肉鴨表皮組織中的松香酸

張?zhí)K珍1,2，耿志明1，王道營1，諸永志1，劉 芳1，張牧焓1，卞 歡1，徐為民1,*

（1.江蘇省農業(yè)科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.南京農業(yè)大學 肉品加工與質量控制教育部重點實驗室，江蘇 南京 210095）

采用高效液相色譜法對肉鴨表皮組織中的松香酸含量進行檢測。肉鴨表皮組織中的松香酸用乙腈提取，經C18固相萃 取柱凈化，采用高效液相色譜-紫外法進行檢測。色譜柱：反相C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：0.003 m ol/L磷酸溶液-甲醇（8∶92，V/V）；流 速：1 mL/min；檢測波長：240 nm。結果表明：方法線性范圍為0.1～10 mg/L，檢出限為0.10 μg/g，定量限為0.33 μg/g。在0.5～50 μg/g的添加 范圍內回收率為82.2%～88.0%。實際樣品分析結果顯示，松香脫毛處理的肉鴨表皮中松香酸含量高達14.52 μg/g。本實驗建立的分析方法簡便快捷、具有較好的靈敏度和可靠性，可用于肉鴨表皮組織中松香酸的定量分析。

肉鴨；松香；松香酸；高效液相色譜法；固相萃取

松香是將松樹的含油樹脂蒸去揮發(fā)的松節(jié)油后得到的透明固體物質，主要成分為松香酸和脫氫松香酸。松香是重要的化工原料，主要用于肥皂、造紙、油漆涂料、黏合劑、橡膠、電氣、建筑材料等工業(yè)[1]。松香加熱后具有良好的黏附性，曾經被廣泛用于鴨、鵝等水禽加工中的二次脫毛工序。毒理學研究表明松香酸可導致人體肺泡上皮細胞溶解，脫氫松香酸對人體紅細胞、多核白細胞有毒性作用[2-7]，Ozaki等[8]發(fā)現脫 氫松香酸和松香酸會損傷DNA的活性；Kamaya等[9]研究了松香酸、脫氫松香酸對大型水蚤生長的影響，發(fā)現二者對水蚤的生長有一定的限制作用。在脫毛加工時，松香酸及脫氫松香酸會通過滲透殘留在鴨、鵝的表皮組織中，食用經松香脫毛加工的禽肉產品將給消費者帶來嚴重的健康隱患。2009年，我國頒布實施《食品安全法》，禁止在畜禽加工中使用松香進行脫毛。但由于批準使用的畜禽脫毛劑（松香酸甘油酯）價格高、且脫毛效果不理想，受利益驅動，不良企業(yè)、作坊違法使用松香進行畜禽脫毛加工的現象十分嚴重。而執(zhí)法部門缺乏有效檢測方法和技術，只能現場監(jiān)管而無法進行產品追溯，也是松香脫毛現象屢禁不止的原因之一。開展水禽中松香脫毛劑殘留物質檢測技術研究，建立相應的檢測方法，可以為執(zhí)法部門打擊違法使用松香脫毛加工畜禽行為提供可靠的檢測依據，對于我國禽類產業(yè)的健康發(fā)展、保護消費者健康具有重要意義。

有關松香酸含量的檢測技術研究包括松香產品質量分析以及某些產品中松香酸的含量分析。松香產品中的松香酸含量主要通過氣相色譜[10-11]或高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）[12-20]進行分析。由于松香酸的毒性作用，某些產品中摻入或殘留的松香酸含量的檢測方法研究也引起了人們關注。李富賢等[21]采用HPLC分析清毒素膠囊中松香酸的含量；Lee等[22]通過HPLC法實現了膠黏劑中松香酸的檢測；Hroboňová等[23]建立了利用液相色譜-質譜分析蜂膠中摻雜的松香酸含量的方法；Nilsson等[20]將HPLC法應用于化妝品中松香酸的檢測。另外，Chow等[24]通過HPLC法檢測了造紙廠紙漿中松香酸的含量；Mitani等[25]則通過HPLC法分析了食品包裝遷移到食品中的松香酸含量。但有關松香在畜禽肉制品中殘留的檢測方法還未見報道。本研究以松香的主要成分松香酸（結構見圖1）為松香脫毛加工肉鴨時在肉鴨表皮組織中的主要殘留標志物，通過樣品提取、凈化條件的確立，以及HPLC分離、檢測條件的優(yōu)化，建立肉鴨表皮組織中松香酸的定性、定量檢測方法。本方法具有操作便捷、靈敏度高、自動化程度高等優(yōu)點，可用于經松香脫毛處理的水禽中殘留松香酸的分析檢測。

圖1 松香酸分子結構Fig.1 Molecular structure of abietic acid

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉鴨購自農貿市場，宰殺后分別采用人工脫毛和松香脫毛，作為陰性樣本和陽性樣本。取不同部位表皮組織，切碎，混合均勻，于－20℃保存。

松香酸標準品（純度95%） 加拿大Helix Biotech公司；乙腈、甲醇（均為色譜純） 美國Tedia公司；水由美國Millipore公司純水儀制備；其余試劑為分析純。

1.2 儀器與設備

Ultimate-3000高效液相色譜（配有VWD-3000紫外檢測器、Chromeleon色譜管理系統(tǒng)軟件、LPG-3400SD四元分析泵、WPS-3000SL自動進樣器） 美國Dionex公司；Xtimate C18色譜柱 美國Welch公司；Biofuge stratos高速離心機 德國Heraeus公司；HS2060A超聲波振蕩器常州國華電器有限公司；PX-12固相萃取裝置 天津譜祥科技有限公司；C18固相萃?。╯olid-phase extraction，SPE）小柱 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

稱取適量松香酸標準品，用甲醇溶解，配制100 mg/L松香酸儲備液。用移液管吸取適量標準儲備溶液，用流動相（0.003 mol/L磷酸溶液-甲醇，8∶92，V/V）稀釋配制質量濃度為0.1～10 mg/L系列工作溶液。

1.3.2 樣品處理

稱取1 g（準確至0.001 g）混合均勻的樣品于10 mL離心管中，加入5 mL乙腈，漩渦振搖后超聲波水浴振蕩10 min，4 000 r/min離心5 min。吸取上清液4 mL，加入4 mL水混勻，通過C18SPE小柱（預先用3 mL乙腈、3 mL水活化），用3 mL 40%乙腈溶液淋洗，最后用2 mL的甲醇洗脫，洗脫液經0.22 μm微孔濾膜過濾，待HPLC分析。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.003 mol/L磷酸溶液-甲醇（8∶92，V/V）；流速：1mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：240nm；進樣量：20μL。

2 結果與分析

2.1 樣品提取及凈化

根據松香酸的性質，樣品用乙腈提取，最終使提取的松香酸溶于40%的乙腈溶液中，上樣于C18SPE小柱。分別觀察40%～60%乙腈溶液淋洗的效果，結果發(fā)現，乙腈體積分數顯著影響凈化效果和松香酸在SPE小柱上的回收率，40%的乙腈溶液使松香酸保留在C18SPE小柱的同時，可有效去除部分雜質。

2.2 色譜條件優(yōu)化

為選擇最佳檢測波長，本實驗采用3波長模式（230、240 nm和250 nm）同時檢測1.0 mg/L的松香酸標準溶液（圖2）。結果表明，松香酸在240 nm波長處有最大吸收峰，且在240 nm波長處基線穩(wěn)定，因此將檢測波長設為240 nm。

圖2 1 mg/L松香酸在不同波長處的HPLC圖Fig.2 HPLC chromatograms of 1 mg/L abietic acid at wavelengths of 230 nm (A), 240 nm (B) and 250 nm (C)

分別配制了3種流動相體系：乙腈-0.1%甲酸溶液（75∶25，V/V）、乙腈-甲醇-0.1%甲酸（7∶2∶1，V/V）以及不同比例的0.003 mol/L磷酸溶液-甲醇，觀察三者對松香酸在C18柱上保留行為的影響。結果發(fā)現，甲醇-磷酸組成的流動相下松香酸的峰形最好，隨著甲醇比例的升高，松香酸保留時間縮短、峰高增加，當流動相0.003 mol/L磷酸溶液-甲醇8∶92（V/V）時，保留時間適中且擁有良好的檢測限。

本實驗還觀察了溫度、流速對松香酸在C18柱上的保留行為的影響，二者對松香酸的保留時間有一定影響，但對檢測靈敏度影響不大，結果表明適宜條件為溫度25 ℃、流速1.0 mL/min。在設定的色譜條件下，松香酸保留時間約10.8 min（圖2）。

2.3 線性范圍、檢出限及定量限

用流動相0.003 mol/L磷酸溶液-甲醇（8∶92，V/V）分別配制質量濃度為0.1、0.5、1.0、1.5、5.0、10.0 mg/L的松香酸系列工作溶液，在240 nm波長處進行HPLC分析。以松香酸質量濃度為橫坐標（x，mg/L），以峰面積為縱坐標（y），得回歸方程y=1.963 4 x＋0.037 5，R2=0.999 8。由此可見在0.1～10 mg/L范圍內，松香酸質量濃度與峰面積呈良好的線性關系。

分別按照3倍信噪比（RSN=3）和10倍信噪比（RSN=10）計算方法的檢出限和定量限，檢出限為0.10 μg/g，定量限為0.33 μg/g。

2.4 精密度實驗

稱取陽性樣品10 g，充分剪碎。平行稱取7份剪碎的陽性樣品，每份精確至1 g。按1.3.2節(jié)樣品前處理方法處理后進樣HPLC測定，記錄峰面積，計算相對標準偏差（RSD），結果見表1。

表1 陽性樣品精密度實驗結果Table 1 Precision (RSDs) for positive samples

2.5 回收率實驗

稱取剁碎的陰性表皮樣品1 g于10 mL離心管中，加入1 mL的0.5、5、50 mg/L的松香酸標準溶液，并在室溫條件下放置1 h（使松香酸滲透至樣品中），然后按1.3.2節(jié)進行樣品處理，按1.3.3節(jié)進行HPLC檢測，比較添加量和檢測量計算添加回收率，結果見表2。在3個不同的水平，松香酸的平均回收率為85.6%。

表2 松香酸不同添加水平回收率測定結果（ =3）Table 2 Recoveries of abietic acid at different spiked levels ( = 3)

2.6 實際樣品分析

分別分析了1個陰性樣品、5個陽性樣品中松香酸的含量，另外對肉鴨屠宰廠C和D的未知樣品C1、C2、C3、D1、D2、D3進行了松香酸含量檢測（表3、圖3）。在陰性樣品中未檢出松香酸，而在陽性樣品中松香酸含量最高達14.52 μg/g，平均值為10.2 μg/g。兩個屠宰廠的未知樣品中均檢測到殘留的松香酸，C和D屠宰廠檢測到的松香酸含量平均值分別為2.58 μg/g和4.40 μg/g。兩家肉鴨屠宰廠的肉鴨表皮中松香酸殘留量顯著小于實驗室自制樣品中的松香酸殘留量，可能是屠宰廠所用脫毛劑除松香外還有其他組分，降低了松香酸在肉鴨表皮中的殘留量。另外，脫毛環(huán)節(jié)工藝條件的不同，也可能導致殘留在成品白條鴨中松香酸含量的差異。

表3 實際樣品分析結果（ =3）Table 3 Abietic acid content in real samples ( = 3)

圖3 樣品的HPLC圖Fig.3 HPLC chromatograms of positive and negative samples

3 結 論

本實驗通過樣品處理條件和色譜條件的優(yōu)化，建立了松香脫毛處理的肉鴨表皮中松香酸的HPLC檢測方法。肉鴨表皮樣品中的松香酸經乙腈超聲波提取，采用C18SPE小柱凈化，然后以0.003 mol/L磷酸溶液-甲醇（8∶92，V/V）為流動相、在反相C18柱上進行分離。線性范圍0.1～10.0 mg/L，檢出限、定量限分別為0.10 μg/g和0.33 μg/g，在0.5～50 μg/g的添加范圍內，平均回收率85.6%。對采用松香脫毛的實際肉鴨樣品進行了檢測，松香酸殘留量最高達14.52 μg/g。對兩個屠宰廠生產的白條鴨進行隨機抽檢，在未知樣品中均檢測到松香酸。結果表明，采用松香脫毛的肉鴨經過整個生產鏈加工后表皮仍殘留松香酸。本方法操作簡便、具有良好的靈敏度和準確性。鑒于松香脫毛現象十分嚴重，以及松香酸具有相當高的穩(wěn)定性，后續(xù)研究將圍繞通過優(yōu)化樣品處理條件和色譜條件，將本實驗建立的方法應用于水禽加工制品（鹽水鴨/鵝、烤鴨、風鵝等）中松香酸殘留的測定。

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Determination of Abietic Acid in Duck Skin Tissue by Solid Phase Extraction-High Performance Liquid Chromatography

ZHANG Su-zhen1,2, GENG Zhi-ming1, WANG Dao-ying1, ZHU Yong-zhi1, LIU Fang1, ZHANG Mu-han1, BIAN Huan1, XU Wei-min1,*
(1. Institute of Agricultural Products Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China; 2. Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Ministry of Education, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

A high-performance liquid chromatographic (HPLC) method was established to determine abietic acid in duck skin. Abietic acid in duck skin samples was extracted with acetonitrile, followed by purification with a C18solid-phase extraction cartridge, and determined by HPLC with an ultraviolet (UV) detector. The chromatographic conditions were established using a C18column (250 mm× 4.6 mm, 5 μm) with a mobile phase consisting of 0.003 mol/L phosphoric acidmethanol (8:92, V/V) at a f ow rate of 1.0 mL/min and the detection wavelength was set at 240 nm. Results indicated that the linearity ranged from 0.1 to 10.0 mg/L, the detection limit of abietic acid was 0.1 μg/g, and the quantif cation limit was 0.33 μg/g. The recoveries from spiked samples at conc entration levels of 0.5–50 μg/g were in the range of 82.2%–88.0%. The developed method was successfully applied to the determination of abietic acid in duck samples epilated with colophony. The content of abietic acid in the duck sample could reach 14.52 μ g/g. This method proved to be of high maneuverability as well as excellent sensitivity and accuracy, and could be used for quantitative analysis of abietic acid in duck skin tissue.

duck; rosin; abietic acid; high performance liquid chromatography (HPLC); sol id phase extraction (SPE)

TS207；O657

A

1002-6630（2014）04-0082-04

10.7506/spkx1002-6630-201404017

2013-04-27

國家自然科學基金青年科學基金項目（31101312）；江蘇省農業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目（CX（12）3082）

張?zhí)K珍（1988—），女，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：xsdzsz@126.com

*通信作者：徐為民（1969—），男，研究員，博士，研究方向為食品科學。E-mail：weiminxu2002@aliyun.com