響應面法優(yōu)化紫蘇籽粕超聲輔助提取原花青素工藝

李 鈺，吳 衛(wèi)*，蘇 華，易 斌

（四川農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，四川 成都 611130）

響應面法優(yōu)化紫蘇籽粕超聲輔助提取原花青素工藝

李 鈺，吳 衛(wèi)*，蘇 華，易 斌

（四川農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，四川 成都 611130）

為充分利用紫蘇資源，優(yōu)化其籽粕原花青素提取工藝，考察了料液比、乙醇體積分數(shù)、超聲功率、溫度、時間對原花青素得率的影響，并根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理，在單因素試驗基礎上選擇主要影響因素進行響應面試驗。響應面優(yōu)化后提取工藝條件為乙醇體積分數(shù)70%、浸提時間0.5 h、浸提溫度70 ℃、超聲功率100 W、料液比1∶15。在此條件下原花青素得率理論值為0.232%，實測值為0.229%。

紫蘇；籽粒；原花青素；響應面法

紫蘇（Perilla frutescent）是傳統(tǒng)的藥食同源植物。蘇葉能發(fā)散風寒、行氣和胃；蘇?？衫須獍蔡?、止痛；蘇子有化痰平喘、潤腑等作用[1-5]。同時該屬植物葉富含氨基酸、微量元素、揮發(fā)油以及紫蘇苷等多種色素成分，其嫩葉可作蔬菜和菜肴著色劑、配菜、調料等，在日本、韓國等地甚為流行；其種子油不飽和脂肪酸含量高，尤以亞麻酸含量最高，可達80%以上，是一種難得的特種食用油源[6]。眾所周知，亞麻酸在人體代謝可生成二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）和二十碳五烯酸（eicosapntemacnioc acid，EPA），被稱為“植物腦黃金”。研究表明，食用紫蘇籽油能提高視網(wǎng)膜反射能力、 增強視力，同時能降低膽固醇含量、降低血脂、抗血栓、抑制腫瘤、延緩衰老等多種功效。紫蘇原產(chǎn)中國，現(xiàn)今主要分布于印度、緬甸、中國、日本等國家，在俄羅斯、日本、韓國、美國、加拿大等均有大量的商業(yè)性栽種[7]。我國是紫蘇出口大國，紫蘇籽產(chǎn)量大概5萬～6萬t，對外出口大部分是以油的形式出口，提油剩下的粕利用較少[8-9]。

原花青素（oligomeric proanthocyanidin，OPC）在結構上是由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素結合形成，具有很強的抗氧化、清除自由基、誘導癌細胞凋亡、改善 人體微循環(huán)、改善骨的形成、促進傷口愈合和組織修復活性、改善實驗小鼠肥胖、改善腸道菌群等多種生物活性等作用[10-12]。有研究表明OPC在許多植物的果實、花、葉、莖及根中均可能含有，且一般在植物果實中含量相對較高[13]。本著充分深度開發(fā)利用紫蘇資源，提高其藥用價值和經(jīng)濟效益，本實驗擬利用超聲波輔助提取脫脂后的紫蘇籽OPC，通過單因素試驗確定各單因素最佳值，再利用單變量多因素方差分析選定3個對提取率影響最為顯著的3個因素，最后通過Box-Behnken設計響應面優(yōu)化分析確定超聲輔助提取紫蘇籽粕OPC的最優(yōu)條件組合。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇籽：2010年采收的種植于遂寧的P06-4號紫蘇品系。該品系為課題組經(jīng)多年選育而成的紫蘇新品系，后經(jīng)四川省農(nóng)作物品種審定委員會審定為“川紫1號”紫蘇新品種。陰干除雜后過60目篩得紫蘇籽粉末。

兒茶素標準品 成都曼 斯特生物試劑有限公司；香蘭素、甲醇、無水乙醇、濃鹽酸均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

UV-2450型紫外分光光度計 日本島津公司；RE-2000旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；HH-4恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；高速中藥HK-04B粉碎機 廣州華凱機械設備有限公司；電子分析天平 沈陽龍騰電子有限公司；SHZ-D（III）循環(huán)水式多用真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠；HF-5.0B超聲循環(huán)水式真空泵 北京弘祥隆生物技術開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取紫蘇籽OPC工藝流程

紫蘇籽粉末→石油醚浸泡脫脂→過濾→殘渣→根據(jù)料液比加入溶劑→提?。刂七m當條件）→抽濾→收集濾液→測定OPC含量→計算得率[14-15]

1.3.2 OPC含量測定方法的選擇和得率計算

目前國際上還沒有統(tǒng)一的OPC含量檢測方法，主要的測定方法包括正丁醇鹽酸法和香草醛法。正丁醇-鹽酸法對OPC化學結構的依賴性較大，選擇性高，OPC與兒茶素單體不發(fā)生顯色反應，因此對于低聚合度OPC的測定并不適宜[16]。而香草醛法較正丁醇鹽酸法而言更靈敏、更專一、更簡潔可行[17]。但在香草醛-硫酸法中，硫酸引起反應體系放熱，且加諸其強氧化作用將共同導致OPC氧化分解，使測定結果偏低[18]。本實驗采用香草醛-鹽酸法，其原理是利用A環(huán)為間苯三酚型的黃烷醇OPC在以鹽酸作為催化劑的條件下會與香草醛發(fā)生酚醛縮合反應，生成紅色產(chǎn)物，并在500 nm波長處有最大吸光度，用分光光度法測定OPC含量[19-20]。

測定以兒茶素[21]為對照品，得到OPC質量濃度（ρ）與吸光度（y）的曲線回歸方程：y=0.3842ρ＋0.0044，r2=0.9992。

OPC得率/%=（ρV/m）×10-3×100

式中：ρ為提取液中OPC質量濃度/（mg/mL）；V為提取液的體積/mL；m為紫蘇籽干質量/g。

1.3.3 紫蘇籽OPC提取的單因素試驗

稱取脫脂紫蘇籽粉末2.0 g，按料液比1∶15加入體積分數(shù)為70%乙醇溶液，50 ℃、300 W超聲提取0.5 h。固定其他條件，分別考察不同料液比（1∶8、1∶10、1∶15、1∶20、1∶30)、浸提溫度（30、40、50、60、70 ℃）、超聲功率（100、200、300、400、500 W）、浸提時間（10、20、30、40、50 min）、乙醇體積分數(shù)（50%、60%、65%、70%、75%）對OPC提取效果的影響。

1.3.4 響應面分析

基于單因素試驗，選擇對OPC得率影響較大的料液比、浸提溫度和超聲功率3個因素，利用Box-Behnken 試驗設計原理，選取5個中心點進行17個試驗，試驗因素水平見表1。

表1 紫蘇籽OPC提取響應面分析試驗因素水平表Table 1 Experimental factors and levels used in response surface analysis

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

由圖1A可見，隨著溫度的升高，OPC得率先升高后降低，到50 ℃和60 ℃時得率增加達到極顯著水平，70 ℃又顯著降低。這是由于溫度升高分子運動加速，進而滲透和擴散速度加快，提取率增加。但溫度過高OPC結構易破壞，導致得率降低。故選擇60 ℃左右是OPC提取的最佳溫度。

通常溶劑用量越大，OPC得率越大。由圖1B可見，隨著提取液用量的增加，OPC得率增加，并且在料液比1∶15之前，隨溶劑增加，OPC得率增加極顯著，而在料液比1∶15之后，得率增加趨于平緩，此時紫蘇籽中OPC已基本全部溶出。考慮過高的提取液用量不僅收益小，而且會增加后序加工的能耗，增加生產(chǎn)成本，所以選擇料液比為1∶15左右為宜。

隨超聲功率的增加，OPC得率提高，由圖1C可見，當功率達到200 W時，再增加功率，提取率增高不顯著，且在300 W后逐漸降低。實質上，隨著功率的增加，超聲波的空化效應和機械效應能量不斷增加，加強了細胞內(nèi)物質的擴散及溶解，使OPC更易轉移至提取液中，OPC得率明顯提高。試驗結果還表明，當超聲功率超過300 W后，得率降低，此時超聲功率早已經(jīng)滿足了使目標產(chǎn)物完全析出的能量，再增加超聲功率則會產(chǎn)生大量無用氣泡，增加了散射衰減，降低了空化強度[22]。因此為節(jié)約能量，選擇超聲功率為200 W。

由圖1D可知，提取時間較短OPC來不及溶出。但提取時間過長，OPC又會因為長時間受熱而發(fā)生結構改變，因此確定提取時間為30 min。

圖1 不同提取條件對紫蘇籽粕OPC得率的影響Fig.1 Effects of process conditions on extraction yield of procyanidins from defatted seed meal of Perilla frutescens

試驗過程中發(fā)現(xiàn)低體積分數(shù)的乙醇提取液很難過濾，而在分級時溶劑界面上出現(xiàn)懸浮的絮狀物，這可能是因為OPC在植物體內(nèi)、分子間通常與蛋白質、多糖等通過氫鍵和疏水鍵形成穩(wěn)定的復合物，且大量水溶性雜質如多糖、果膠、蛋白質、色素等成分隨之溶出，影響OPC的溶出。當乙醇體積分數(shù)太大，則會產(chǎn)生很大的滲透壓，醇溶性雜質、色素和親脂性強的成分溶出增多，這些成分會與OPC競爭乙醇-水分子，使得OPC溶出減少，進而導致OPC提取率下降[23]。由圖1E可見，各乙醇體積分數(shù)提取間，OPC得率無顯著差異，為方便過濾操作，選擇70%的乙醇體積分數(shù)。

2.2 OPC提取的響應面分析

2.2.1 響應面試驗設計及結果

表2 紫蘇籽OPC提取響應面分析試驗設計及結果Table 2 Scheme and experimental results of response surface Box-Behnken dessiiggnn

根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理[24]，綜合單因素影響試驗結果，選擇溫度（X1）、料液比（X2）、超聲功率（X3）對OPC提取影響顯著的3個因素，在單因素試驗基礎上采用三因素三水平的響應面分析法。單因素試驗結果顯示：在提取溫度60 ℃、料液比1∶15、功率200 W時，紫蘇籽中的OPC有最大得率。超聲法提取紫蘇籽中OPC的響應面試驗設計方案與試驗結果見表2。

2.2.2 模型的建立及顯著性檢驗

利用Design-Expert V8.0.6.統(tǒng)計軟件對表2所得試驗數(shù)據(jù)結合表3進行多元回歸擬合分析，剔除不顯著項，得到OPC得率（Y）對溫度（X1）、料液比（X2）、超聲功率（X3）的多元二次回歸方程模型為：

由表3分析結果可以看出，因素X1（溫度）對OPC得率呈極顯著（P＜0.01）影響，X3（超聲功率）對OPC得率呈顯著影響，因素X1X3和X2X3對響應值的曲面效應也呈顯著影響，由此可以得出結論：溫度和超聲功率是紫蘇籽OPC提取工藝中重要的影響因素，根據(jù)F值的大小，確定該3個因素對OPC提取率的影響大小為：X1（溫度）＞X3（超聲功率）＞X2（料液比）。

對多元回歸方程進行方差分析，雖然失擬項顯著，但其中二次響應面回歸模型的F值為12.99，響應值變異系數(shù)（CV）為12.58%，模型回歸關系達到高度的極顯著水平（P=0.0014），且R2=0.9435，調整決定系數(shù)R2Adj=0.8709，RSN為16.219，遠大于5，說明該模型能解釋87.09%響應值的變化，能在一定程度下對不同提取條件下的OPC得率進行預測。

表3 回歸方程各項的方差分析結果Table 3 Analysis of variance for each term in the response surface regression mooddeell

2.2.3 響應面分析

響應曲面分析法優(yōu)化圖形為響應值Y與對應的因素間構成的三維圖及在二維平面上的等高圖，綜合直觀地反映各因素對響應值的影響，每個響應面對其中兩個因素進行分析，另外一個因素固定在零水平上?；貧w優(yōu)化響應面圖分別見圖2。比較2組圖并結合表3中P值可知：模型的一次項X1極顯著，X2不顯著，X3顯著，X1X3、X2X3交互項顯著，X1X2交互項不顯著。二次項X12極顯著，X22顯著，表明這兩個影響因素對得率不是簡單的線性關系。由圖2可知，等高線的形狀可反映出交互效應的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，溫度對得率影響最為顯著，表現(xiàn)為曲面比較陡；其次是超聲功率，再是料液比，表現(xiàn)為曲面比較平滑。

圖2 各因素交互作用響應面圖和等高線Fig.2 Response surface and contour plots showing the pairwise interaction effects of various hydrolysis conditions on the extraction yield of procyanidins

2.2.4 最佳工藝條件驗證

軟件分析得到最大的響應值為0.231 687%，即OPC得率預測值最高為0.231 687%，與之對應的預測工藝條件為：浸提溫度70 ℃、超聲功率100 W、料液比1∶15.55（g/mL）。根據(jù)實際操作，對工藝條件進行簡單處理，在乙醇體積分數(shù)為70%、浸提時間為0.5 h、浸提溫度70 ℃、超聲功率100 W、料液比1∶15.5（g/mL）的條件下進行2次驗證實驗，OPC得率的實測值為0.229%，與預測的理論值相接近，驗證了此模型的有效性。

3 結 論

本實驗采用響應面分析法優(yōu)化紫蘇籽OPC的提取工藝，在溫度、料液比、超聲功率3個因素中，溫度對紫蘇籽OPC的得率的影響達到了極顯著水平，超聲功率達到顯著水平，而料液比對紫蘇籽OPC得率的影響不顯著，3個因素的主次關系為：溫度＞超聲功率＞料液比。利用Design-Expert V8.0.6.軟件對BBD試驗數(shù)據(jù)進行分析，結果表明，紫蘇籽OPC超聲輔助最佳提取條件為浸提溫度70 ℃、超聲功率100 W、料液比1∶15.55（g/mL），OPC得率理論預測值為0.232%，實測值為0.229%。為紫蘇中OPC開發(fā)與利用提供一定的參考價值和理論基礎。

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Optimization of Ultrasound-Assisted Extraction of Proanthocyanidins from Perilla frutescens Using Response Surface Methodology

LI Yu, WU Wei*, SU Hua, YI Bin
(College of Agronomy, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China)

The ultrasound-assisted extrac tion of proanthocyanidi ns from defatted seed meal of Perilla frutescens was optimized in the present work. The effects of solid-to-liquid ratio, ethanol concentration, ultrasound power, temperature and extraction time on the extraction yield of proanthocyanidins were evaluated. Main inf uencing factors were selected based on the results of single factor experiments and optimized using response surface methodology according to the principle of Box-Behnken design. The optimal extraction conditions were determined as follows: extraction with a 15-fold volume of 70% aqueous ethanol solution at 70 ℃ with an ultrasound power of 100 W for 0.5 h. Under these conditions, the theoretically predicted yield of procyanidins was 0.232%, and the actually measured value was 0.229%.

Perilla frutescent; seed meal; procyanidins; response surface analysis

TS224.4

A

1002-6630（2014）04-0050-05

10.7506/spkx1002-6630-201404011

2013-06-14

四川農(nóng)業(yè)大學科技成果轉化項目（3523519）

李鈺（1988—），女，碩士，研究方向為藥用植物學 。E-mail：lookingforbluemoon@qq.com

*通信作者：吳衛(wèi)（1970—），女，教授，博士，研究方向為藥用植物學。E-mail：ewuwei@gmail.com