天冬氨酸激酶突變體G277K中AK基因的克隆表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)表征

任 軍，閔偉紅*，詹冬玲，方 麗，李慧穎，朱運(yùn)明

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，小麥和玉米深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130118）

天冬氨酸激酶突變體G277K中AK基因的克隆表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)表征

任 軍，閔偉紅*，詹冬玲，方 麗，李慧穎，朱運(yùn)明

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，小麥和玉米深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130118）

通過(guò)序列比對(duì)和晶體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，天冬氨酸激酶（aspartokinase，AK）的G277位點(diǎn)高度保守，并與抑制劑Thr通過(guò)氫鍵相連，對(duì)其進(jìn)行定點(diǎn)突變和酶學(xué)性質(zhì)表征。結(jié)果表明：突變體G277K的AK最適反應(yīng)條件是30 ℃、pH 8.5；動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示突變體AK的正協(xié)同效應(yīng)降低，趨向于米氏酶，參數(shù)S0.5、nH、酶比活力、Vmax分別是7.05 mmol/L，1.24、964.3 U/mg、32.143U/（mg·min）；熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)顯示，其30 ℃半衰期為2.3 h，3 h后酶活力喪失80%左右；Ni2+在低濃度時(shí)表現(xiàn)出顯著的激活效應(yīng)；有機(jī)溶劑丙三醇、異丙醇和二甲基亞砜的體積分?jǐn)?shù)為1%時(shí)，對(duì)AK的酶活力有很好的激活作用，表明突變體AK對(duì)一些有機(jī)溶劑有一定的抗性；低濃度的賴氨酸和蛋氨酸對(duì)AK有激活作用。

天冬氨酸激酶；克隆表達(dá)；定點(diǎn)突變；酶學(xué)性質(zhì)

天冬氨酸激酶（aspartokinase，AK）廣泛存在于細(xì)菌、植物和真菌中，例如Corynebacterium glutamicum[1]、Brevibacterium crenatum[2]和Corynebacterium f avum。AK是合成蘇氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸途徑中的關(guān)鍵酶，并且是第一個(gè)關(guān)鍵酶，催化合成這4種必需氨基酸的第一步反應(yīng)[3]。AK僅存在于微生物和植物中，而在動(dòng)物和人體內(nèi)不存在，所以動(dòng)物和人類(lèi)必須從食物中獲取天冬氨酸合成途徑的必需氨基酸。在生物合成過(guò)程中，該酶受到支路產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)，尤其是蘇氨酸和賴氨酸反饋抑制以及協(xié)同反饋抑制[4]。大腸桿菌（E. coli）中存在3種AK異構(gòu)酶形式，AK1、AK2和AK3。AK1和AK3是兩種別構(gòu)酶，主要影響蘇氨酸和賴氨酸的生產(chǎn)，兩者的別構(gòu)抑制劑分別是蘇氨酸[5]和賴氨酸[6-7]。如果對(duì)AK基因進(jìn)行深入研究，改變天冬氨酸合成途徑中氨基酸的代謝調(diào)控，會(huì)對(duì)這些氨基酸的合成具有很大的實(shí)用價(jià)值和理論意義。因此，天冬氨酸途徑中關(guān)鍵酶AK引起了人們的廣泛關(guān)注[8-9]。

AK是四聚體結(jié)構(gòu)，由兩個(gè)α亞基和兩個(gè)β亞基構(gòu)成，形成α2β2四聚體結(jié)構(gòu)。α亞基包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，即N末端催化結(jié)構(gòu)域和C末端調(diào)控結(jié)構(gòu)域。β亞基與α亞基調(diào)控結(jié)構(gòu)域相同[10]，由兩個(gè)ACT結(jié)構(gòu)域基序組成，以βαββαβ折疊結(jié)構(gòu)存在。ACT結(jié)構(gòu)域是許多別構(gòu)酶的別構(gòu)劑結(jié)合位點(diǎn)[11]，目前已知ACT結(jié)構(gòu)域含有兩個(gè)蘇氨酸結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè)賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)。Moir 等[11]已經(jīng)總結(jié)出了α亞基與AK的催化活性和調(diào)控功能有關(guān)，而β亞基對(duì)AK穩(wěn)定性起重要作用。本實(shí)驗(yàn)的研究目標(biāo)是北京棒桿菌E31中的AK。目前結(jié)構(gòu)已知并與其同源性最高的是來(lái)自谷氨酸棒桿菌的AK（PDB ID：3aaw），其結(jié)構(gòu)也是由兩個(gè)α亞基和兩個(gè)β亞基組成α2β2四聚體。為了提高AK蛋白的酶活性，利用生物信息學(xué)確定影響天冬氨酸激酶活性中心和抑制劑的7個(gè)作用位點(diǎn)。根據(jù)谷氨酸棒桿菌的三維晶體結(jié)構(gòu)圖3aaw找到了與這7個(gè)位點(diǎn)通過(guò)氫鍵相連的氨基酸，將不同菌株中AK的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，如圖1所示，G277位點(diǎn)具有高度的保守性。由3aaw晶體結(jié)構(gòu)解析（圖2）可知，C鏈抑制劑位點(diǎn)Thr501通過(guò)氫鍵與幾個(gè)氨基酸位點(diǎn)相連，其中包括高度保守的氨基酸突變位點(diǎn)Gly(G) 277。

本實(shí)驗(yàn)采用定點(diǎn)突變技術(shù)，對(duì)G277位點(diǎn)進(jìn)行突變，得到突變株G277K，然后對(duì)其AK進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)及酶學(xué)性質(zhì)表征[12-13]，試圖闡明AK的調(diào)節(jié)機(jī)制，解除末端產(chǎn)物對(duì)AK的反饋抑制，為天冬氨酸族氨基酸基因工程菌的構(gòu)建提供參考。

圖1 AK的多重序列比對(duì)Fig.1 Multiple sequence alignment of AK

圖2 AK抑制劑Thr的結(jié)合位點(diǎn)Fig.2 Inhibitor Thr binding site of AK

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

北京棒桿菌E31由本課題組保存，其天冬氨酸激酶基因連接在pET-28a質(zhì)粒上，保存于克隆宿主E. coli DH5α和表達(dá)宿主E. coli BL21（DE3）中。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

核酸和蛋白電泳Marker、Taq聚合酶及定點(diǎn)突變?cè)噭┖?日本TaKaRa公司；DpnⅠ酶 生工生物工程（上海）有限公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）、卡那霉素 北京鼎國(guó)生物公司；質(zhì)粒抽提試劑盒 北京天澤恩公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris、過(guò)硫酸鈉、硫酸卡那霉素、β-巰基乙醇 美國(guó)Genview公司；PVDF膜 美國(guó)Bio-Rad公司。

LB培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[14]配制；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白電泳試劑的配制參照文獻(xiàn)[15]配制。

1.1.3 儀器與設(shè)備

UV1700紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)HermLe公司；蛋白質(zhì)電泳裝置美國(guó)GE公司；PCR儀 Eppendorff中國(guó)有限公司；高壓蒸汽滅菌器 日本ALP公司。

1.2 方法

1.2.1 突變體的克隆表達(dá)

將北京棒桿菌E31中AK基因在大腸桿菌BL21中表達(dá)。提取重組質(zhì)粒，以其為模板進(jìn)行定點(diǎn)突變PCR擴(kuò)增。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，上下游引物分別是5’-GGAAAACCTTCGCAGCCTCTTTTGGC TTATCGG-3’和5’-CTGGGTATTTCCGATAAGCCAAAAG AGGCTGCG-3’。其中下劃線為引入的突變位點(diǎn)，將277號(hào)氨基酸位點(diǎn)的不帶電荷的中性氨基酸G突變成帶正電荷的堿性氨基酸K。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行消化，轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，平板培養(yǎng)。將平板中的單克隆接種于試管中，37 ℃、180 r/min搖床過(guò)夜培養(yǎng)。將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液送生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序。 取測(cè)序成功后的突變菌株在37 ℃、200 r/min，搖床培養(yǎng)1.5～2 h，待菌液OD540nm值到達(dá)0.6～0.8時(shí)加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。對(duì)誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)轉(zhuǎn)速、誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)不同的誘導(dǎo)劑濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol/L）、不同的誘導(dǎo)溫度（26、28、30、32、34、36、38、40、42 ℃）、不同的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)速（110、120、130、140、150、160、170、180、190 r/min）、不同的誘導(dǎo)時(shí)間（3、4、5、6、7、8、9、10、11 h）分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，篩選出最佳誘導(dǎo)條件。

1.2.2 突變體AK的分離純化及鑒定

將誘導(dǎo)后的發(fā)酵液于4 ℃、8 000 r/min離心10 min，棄去上清液。加入預(yù)冷的pH 7.4磷酸鹽緩沖液沖洗、重懸。充分混勻后，于4 ℃中進(jìn)行超聲波破碎，將上清液過(guò)0.45 μm膜，濾液為含AK蛋白的粗酶液。將所得AK蛋白粗酶液通過(guò)非變性鎳柱進(jìn)行分離純化，先后用20mmol/L咪唑20 mL、40 mmol/L咪唑15 mL、70 mmol/L咪唑10 mL、100 mmol/L咪唑5 mL以及200 mmol/L咪唑3 mL洗脫除去雜質(zhì)蛋白質(zhì)，用500 mmol/L咪唑10 mL洗脫得到純化后AK蛋白。將500 mmol/L咪唑洗脫下的酶液透析，聚乙二醇濃縮，進(jìn)一步純化，SDS-PAGE和蛋白印跡（Western blotting）進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.3 SDS-PAGE和Western blotting

純化后AK蛋白采用SDS-PAGE驗(yàn)證；將含有目的蛋白AK的SDS-PAGE切下，15V穩(wěn)壓電轉(zhuǎn)1h至PVDF膜上，2%～5%脫脂奶粉封閉，經(jīng)HRP Mouse Anti-6xHis（用TBS按1∶2500稀釋）孵化2h，DAB顯色7～10min。

1.2.4 AK酶活力測(cè)定

利用分光光度計(jì)檢測(cè)天冬氨酸異羥肟酸在540 nm波長(zhǎng)處的吸光度來(lái)測(cè)定AK的活性[16-18]。1 mL反應(yīng)體系：10 mmol/L底物L(fēng)-天冬氨酸，10.4 mmol/L ATP，10 mmol/L β-巰基乙醇，100 mmol/L Tris-HCl緩沖液 (pH 8.5)，1.6 mmol/L MgSO4，800 mmol/L NH4OH和800 mmol/L KCl。反應(yīng)體系中加入純化后的AK蛋白至總體積1 mL，于30 ℃下反應(yīng)30 min，加入1 mL FeCl3終止試劑，離心5 min除去蛋白質(zhì)雜質(zhì)，取上清液測(cè)其OD540nm值。以不加底物天冬氨酸作為對(duì)照，所測(cè)得OD540nm即為天冬氨酸異羥肟酸離子的光密度，酶活力表示為1 000×OD540nm值。反應(yīng)速率V定義為單位時(shí)間（1 min）內(nèi)單位質(zhì)量酶的催化能力，單位表示為U/（mg·min）。酶液中AK蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。

1.2.5 AK動(dòng)力學(xué)檢測(cè)

AK動(dòng)力學(xué)檢測(cè)以L-天冬氨酸為底物，Tris-HCl（pH 8.5）為緩沖液，在30 ℃測(cè)定0.5～16.0 mmol/L底物濃度范圍內(nèi)的酶活力，每次3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。以Hill方程V=Vmax[S]n/(K＋[S]n)進(jìn)行非線性擬合。

1.2.6 最適反應(yīng)溫度與pH值

大多數(shù)微生物中的AK都是一種偏堿性酶，因此AK最適pH值的測(cè)定是以天冬氨酸為底物，在pH值6.5～10.0范圍內(nèi)的100 mmol/L Tris-HCl緩沖液中進(jìn)行酶活力檢測(cè)。AK最適反應(yīng)溫度的測(cè)定是以天冬氨酸為底物，在不同反應(yīng)溫度下（15、20、25、28、30、35、40、45、50 ℃ ）反應(yīng)30 min，然后測(cè)定OD540nm值。酶活力測(cè)定方法同1.2.4節(jié)，每次都做3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 熱穩(wěn)定性

在最適溫度條件下，將純化后的AK蛋白溶液裝入離心管中，以石蠟油封頂置于水浴鍋中，每隔1 h取樣測(cè)定其AK酶活力，測(cè)定方法同1.2.4節(jié)，每次都做3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。在最適反應(yīng)溫度下，將AK蛋白水浴0 h測(cè)得的數(shù)據(jù)定義為100%。

1.2.8 金屬離子與有機(jī)溶劑對(duì)酶活力的影響

金屬離子對(duì)AK酶活力的影響是通過(guò)在反應(yīng)體系中添加不同濃度（0.2、1.0、5.0、10.0mmol/L），不同種類(lèi)金屬離子[19]（Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+），其他條件均與酶活力測(cè)定方法一致，觀察對(duì)AK酶活力的影響，每次都做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。將沒(méi)有添加任何金屬離子的酶活力定義為100%。

有機(jī)溶劑對(duì)AK酶活力的影響是通過(guò)在反應(yīng)體系中添加不同體積分?jǐn)?shù)（1%、5%、10%、20%），不同種類(lèi)的有機(jī)溶劑（甲醇、乙醇、丙三醇、異丙醇、乙腈、正丁醇、二甲基亞砜），其他條件均與酶活力測(cè)定方法一致，觀察其對(duì)AK酶活力的影響，每次都做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。將沒(méi)有添加任何有機(jī)溶劑的酶活力定義為100%。

1.2.9 底物抑制劑對(duì)酶活力的影響

抑制劑對(duì)AK酶活力的影響是通過(guò)在反應(yīng)體系中添加不同濃度（0.2、1.0、5.0、10.0mmol/L），不同種類(lèi)的底物抑制劑（蛋氨酸（Methionine，Met），賴氨酸（Lysine，Lys），蘇氨酸（Threonine，Thr），Thr＋Met、Lys＋Met、Lys＋Thr、Lys＋Thr＋Met），其他條件均與酶活力測(cè)定方法一致，觀察其對(duì)AK酶活力的影響，每次都做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。將沒(méi)有添加抑制劑的酶活力定義為100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體AK基因的克隆與表達(dá)

將突變后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，突變體和野生型AK的核酸序列大小均在1.3kb左右，與汪一名等[20]所報(bào)道的結(jié)果相符。核酸序列經(jīng)生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序，篩選定點(diǎn)突變成功的菌株，得到突變體G277K。

圖3 野生型和突變體的1%瓊脂糖凝膠電泳Fig.3 1% agarose gel electrophoresis of wild-type and mutant G277K

圖4 10%SDS-PAGE蛋白電泳圖Fig.4 10% SDS-PAGE of AK protein from G277K

圖5 突變體G277K分離純化后AK的蛋白電泳及蛋白印跡圖Fig.5 10% SDS-PAGE and western blotting of purified AK protein from mutant G277K

對(duì)誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)轉(zhuǎn)速、誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，篩選出最佳的誘導(dǎo)條件，分別為：1mmol/L IPTG、30℃、130r/min、8h。對(duì)誘導(dǎo)前后發(fā)酵液的菌液及破碎后的上清液分別做10% SDS-PAGE蛋白電泳，如圖4所示，其發(fā)酵液經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)后比未誘導(dǎo)的多了一條很明顯的粗帶。經(jīng)過(guò)細(xì)胞破碎離心過(guò)濾后，得到了破碎離心上清液樣品，在相應(yīng)位置也得到了比較亮的條帶，但上清液中也明顯的顯示了雜蛋白的條帶。通過(guò)對(duì)上清液進(jìn)行非變性鎳柱分離純化，將純化后AK蛋白溶液進(jìn)行SDSPAGE變性蛋白電泳和Western blotting。如圖5所示，在同樣的分子大小位置出現(xiàn)了單一的目標(biāo)蛋白，其分子質(zhì)量大約為48kD。這與Follettie等[18]所報(bào)道的結(jié)果一致。Western blotting結(jié)果顯示，在48kD同樣出現(xiàn)了一條單帶，這說(shuō)明突變后的AK蛋白表達(dá)成功。200mL的野生型發(fā)酵液分離純化出AK蛋白3.37mg，純度在90%以上，測(cè)得的酶比活力為91.99U/mg，總的純化效率是純化前11.09倍。突變株G277K的酶比活力較野生型有所提高，提高了9.48倍，為964.3U/mg。

2.2 突變體的動(dòng)力學(xué)

圖6 突變體G277K的酶動(dòng)力學(xué)曲線Fig.6 Steady-state kinetic curve of mutant G277K

通過(guò)Origin75軟件，將得出的突變體G277K動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)曲線擬合，結(jié)果如圖6所示。野生型AK動(dòng)力學(xué)曲線擬合符合Hill方程，天冬氨酸激酶含有四聚體結(jié)構(gòu)，是典型的別構(gòu)酶[5-7]。對(duì)野生型AK而言，nH為3.49、Km為4.42mmol/L、Vmax為3.066U/（mg·min），具有明顯的正協(xié)同效應(yīng)；結(jié)合lg（V/（Vm－V））對(duì)lgS可知，突變體G277K的Vmax是32.143U/（mg·min），比Maximillian等[18]報(bào)道的最大值24.4U/（mg·min）要高。酶比活力為964.3U/mg，nH為1.24，Km為7.05mmol/L。突變體G277K的正協(xié)同效應(yīng)降低，趨向于米氏酶，而活力提高了9.48倍。這可能是277位點(diǎn)的G由不帶電荷的中性氨基酸突變成帶正電荷的堿性氨基酸K后，使其在一定程度上破壞了與抑制劑Lys間的非共價(jià)鍵作用，導(dǎo)致AK亞基間聚合度降低，結(jié)構(gòu)松散，抑制劑結(jié)合位點(diǎn)變得松散不穩(wěn)定，從而不利于抑制劑的結(jié)合。

2.3 突變體的酶學(xué)性質(zhì)表征

2.3.1 突變體AK的最適反應(yīng)pH值和最適反應(yīng)溫度

圖7 突變體G277K中AK的最適pH值曲線Fig.7 Optimum pH curve of AK from G277K

由圖7可知，突變體G277K中AK是偏堿性酶，其最適pH值為8.5。在pH值6.0～8.5范圍內(nèi)，突變體AK酶活力隨pH值的升高而增強(qiáng)，當(dāng)高于pH8.5后，酶活性隨著pH值的升高反而下降。野生型的最適pH值為8.0，可能是因?yàn)镚277位點(diǎn)對(duì)AK活性中心親核殘基催化進(jìn)攻的質(zhì)子傳遞有影響。

圖8 突變體G277K中AK的最適反應(yīng)溫度曲線Fig.8 Optimum temperature curve of AK from G277K

由圖8可知，G277K中AK的最適反應(yīng)溫度為30 ℃。在15～30 ℃范圍內(nèi)，突變體酶的催化活性隨著溫度的升高而增高，當(dāng)高于30 ℃后，隨著溫度的升高酶活力下降。野生型中AK的最適溫度為26 ℃，突變體最適反應(yīng)溫度提高，可能是因?yàn)榇宋稽c(diǎn)影響酶的空間構(gòu)象，因而最適反應(yīng)溫度提高。

2.3.2 野生型及突變體中AK的熱穩(wěn)定性

圖9 突變體G277K中AK的熱穩(wěn)定性曲線Fig.9 Thermal stability curve of mutant G277K

由圖9可知，突變體G277K中AK的熱穩(wěn)定良好，其半衰期為2.3h，比野生型的4h要低。這可能是因?yàn)橥蛔凅w酶亞基間的聚合度減弱，因而熱穩(wěn)定性降低。3h后突變體G277K的AK酶活力已經(jīng)喪失了80%左右。

2.3.3 金屬離子對(duì)AK酶活力的影響

多數(shù)金屬離子都會(huì)影響酶活性[21]。在使用與測(cè)酶活力相同的Cl－和SO42－作為陰離子的條件下，通過(guò)添加不同濃度、不同種類(lèi)的金屬離子來(lái)檢測(cè)金屬離子對(duì)突變體中AK酶活力的影響，結(jié)果如表1所示。

表1 金屬離子對(duì)突變體G277K中AK酶活力的影響Table1 Effect of metal ions on the enzymatic activity of AK from mutant G227777KK

由表1可知，對(duì)突變體G277K而言，一價(jià)金屬離子Na+對(duì)酶活力無(wú)激活作用，而是顯示出了抑制作用。K+在0.2mmol/L時(shí)對(duì)酶有激活效應(yīng)，而濃度增加顯示出抑制效應(yīng)；二價(jià)金屬離子Ni2+在低濃度時(shí)表現(xiàn)出顯著的激活效應(yīng)，當(dāng)濃度增大時(shí)呈現(xiàn)出明顯的抑制作用。低濃度的Mg2+和Cu2+對(duì)酶活力起到了一定的抑制作用，但是高濃度時(shí)酶活力得到了增強(qiáng)，表現(xiàn)出了激活作用，當(dāng)Mg2+和Cu2+的濃度為10mmol/L時(shí)，其相對(duì)酶活力分別為131.63%和138.86%。而Ca2+、Zn2+、Mn2+、Fe3+對(duì)酶活力都起到了抑制作用。這些低濃度的金屬離子對(duì)突變體AK酶產(chǎn)生的激活作用可能是由于277號(hào)位點(diǎn)氨基酸的電荷和極性的改變而引起了活性中心位點(diǎn)與金屬離子結(jié)合的難易程度，從而對(duì)催化活性中心位點(diǎn)產(chǎn)生不同的激活或者抑制效應(yīng)。

2.3.4 有機(jī)溶劑對(duì)AK酶活力的影響

到目前為止，有機(jī)溶劑對(duì)很多酶活力的影響機(jī)理尚未清楚[22]。為了研究突變后AK對(duì)有機(jī)溶劑的抗性，分別選取了不同體積分?jǐn)?shù)的一元醇、二元醇以及三元醇對(duì)突變體AK酶活力的影響，尤其以檢測(cè)二甲基亞砜來(lái)判斷酶對(duì)有機(jī)溶劑的抗性影響是很多研究有機(jī)溶劑對(duì)酶活力的影響中用到的實(shí)驗(yàn)[22]。有機(jī)溶劑對(duì)突變體AK酶活力的影響結(jié)果如表2所示。大部分有機(jī)溶劑對(duì)G277K突變體酶活力有抑制作用。對(duì)突變體G277K而言，當(dāng)丙三醇、異丙醇和二甲基亞砜的體積分?jǐn)?shù)為1%時(shí)，對(duì)AK的酶活力有很好的激活作用，但是隨著體積分?jǐn)?shù)的增高都表現(xiàn)出了明顯的抑制作用，且抑制程度隨著體積含量的增高而加強(qiáng)。其相對(duì)酶活力分別由體積分?jǐn)?shù)為1%時(shí)192.53%、114.30%和149.02%的激活效應(yīng)轉(zhuǎn)變成為體積分?jǐn)?shù)為20%時(shí)17.22%、ND和36.12%的抑制效應(yīng)。其余的有機(jī)溶劑對(duì)突變體G277K酶活力都有不同程度的抑制作用，其中甲醇和乙腈對(duì)AK的抑制作用隨著有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)的增大而增強(qiáng)，當(dāng)甲醇和乙腈的體積分?jǐn)?shù)為20%時(shí)，其相對(duì)酶活力分別為13.33%和21.12%。乙醇對(duì)G277K酶活力仍有很強(qiáng)的抑制作用。正丁醇對(duì)G277K酶活力也有一定的抑制作用，當(dāng)其體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，酶活力反而增強(qiáng)，其相對(duì)酶活力達(dá)到了133.36%。結(jié)果顯示突變體AK對(duì)不同體積分?jǐn)?shù)的有機(jī)溶劑表現(xiàn)出不同的抗性。相比于野生型而言，對(duì)有機(jī)溶劑具有更高的抗性，從而減少了AK在有機(jī)溶劑中的失活率，在一定程度上，提高了其應(yīng)用范圍和存儲(chǔ)環(huán)境。

表2 有機(jī)溶劑對(duì)突變體G277K中AK酶活力的影響Table2 Effect of organic solvents on the enzymatic activity of AK from mutant G277K

2.3.5 底物抑制劑對(duì)AK酶活力的影響

表3 底物抑制劑對(duì)突變體G277K中AK酶活力的影響Table3 Effect of inhibitors on the enzymatic activity of AK from mutant G227777KK

由表3可知，對(duì)突變體G277K而言，蘇氨酸、賴氨酸和蛋氨酸對(duì)于AK的催化活性依然有很大的抑制作用。但是低濃度的賴氨酸和蛋氨酸對(duì)AK反而有激活作用。當(dāng)賴氨酸的濃度為1mmol/L時(shí)，其相對(duì)酶活力為121.22%。當(dāng)?shù)鞍彼岬臐舛葹?.2mmol/L時(shí)，其相對(duì)酶活力為144.37%。并且在這些氨基酸的組合中，當(dāng)濃度為0.2mmol/L時(shí)，含有蛋氨酸的組合都不同程度地促進(jìn)了AK的酶活力，其中最大的是蘇氨酸和蛋氨酸的組合，其相對(duì)酶活力達(dá)到了216.87%。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)突變體G277K中天冬氨酸激酶進(jìn)行基因克隆表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)表征，結(jié)果顯示：突變體G277K中AK趨向于米氏酶，動(dòng)力學(xué)參數(shù)S0.5、nH和Vmax分別是7.05mmol/L、1.24和32.143U/（mg·min）；突變體G277K的酶比活力是964.3U/mg，比野生型菌株提高了9.48倍。突變體酶的最適反應(yīng)溫度為30℃、最適pH值為8.5、半衰期為2.3h。對(duì)有機(jī)溶劑有一定的抗性，并且1%丙三醇、異丙醇和二甲基亞砜對(duì)G277K有很好的激活作用。低濃度的賴氨酸和蛋氨酸對(duì)G277K中AK的抑制作用消除，呈現(xiàn)出激活作用。這為更進(jìn)一步構(gòu)建高產(chǎn)蘇氨酸、賴氨酸或蛋氨酸的工程菌提供理論基礎(chǔ)。

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Gene Cloning, Expression and Enzymatic Characterization of Aspartokinase Mutant G277K

REN Jun, MIN Wei-hong*, ZHAN Dong-ling, FANG Li, LI Hui-ying, ZHU Yun-ming
(National Engineering Laboratory on Wheat and Corn Further Processing, College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Aspartokinase (AK), a crucial enzyme used in the industrial production of amino acids, is a rate-limiting enzyme in the biosynthesis of amino acids of the aspartate family, in which AK is strictly regulated by the feedback of these amino acids. This study aimed to relieve the metabolic regulation and to create genetically engineered strains that have a high production of those amino acids. By using the substrate docking and virtual screening, we found the highly conserved mutation sites of Gly (G) 277 which were bound with Thr501 inhibitory site by hydrogen bonds. The results showed that the optimal pH, temperature and half-life of the mutant enzyme were 8.5, 30℃ and 2.3 h, respectively. Steady-state kinetic study showed that the positive synergistic effect was reduced, and tended to become a Michaelis enzyme. The parameters S0.5, nH, specific activity and Vmaxwere 7.05 mmol/L, 1.24, 964.3 U/mg and 32.143 U/(mg·min), respectively. Ni2+showed significant activation effect at low concentrations. The AK enzyme activity was activated when glycerol, isopropanol or dimethyl sulfoxide was present at a level of 1% by volume, suggesting the resistance of the mutant enzyme to these organic solvents. Lysine and methionine at low concentrations were also able to activate the enzyme activity.

aspartokinase (AK); cloning and expression; site-directed mutation; enzymatic properties

Q814.9

A

1002-6630（2014）11-0149-06

10.7506/spkx1002-6630-201411030

2013-05-28

吉林省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20130101139JC）

任軍（1988—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵微生物的選育與代謝調(diào)控。E-mail：renjun881022@163.com

*通信作者：閔偉紅（1971—），女，教授，博士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程、糧食科學(xué)與深加工技術(shù)。E-mail：minwh2000@163.com