碎囊毛霉產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)

丁葉梅，贠建民*，魏 龍，陳 芳，艾對元，張紊瑋

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

碎囊毛霉產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)

丁葉梅，贠建民*，魏 龍，陳 芳，艾對元，張紊瑋

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

基于碎囊毛霉M-28固態(tài)發(fā)酵方式，采用單因素試驗(yàn)對其所產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶進(jìn)行提取純化條件優(yōu)化，并開展部分酶學(xué)性質(zhì)研究。結(jié)果表明：用 pH 5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液在200 r/min浸提固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)30 min， 所得粗酶液經(jīng)飽和度80%硫酸銨鹽析、24 h透析濃縮、Sephadex G-100柱層析分離后，經(jīng)紫外分光光度計檢測，得到2 個蛋白峰，酶活力測定發(fā)現(xiàn)有一個峰具有酶活性，收集該酶活組分并采用聚乙二醇高度吸附濃縮，再用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法進(jìn)行純度檢驗(yàn)，純化酶蛋白呈單一譜帶，分子質(zhì)量約為17.2 kD，酶比活力達(dá)到225.02 U/mg，純度較粗酶液提高了2.48 倍。酶的最適反應(yīng)溫度為55 ℃、在40～50 ℃時相對穩(wěn)定，其最適pH值為5.5、酶活力在pH 4.5～5.5條件下相對穩(wěn)定。Fe3+和Al3+對該酶具有明顯抑制作用，F(xiàn)e2+對其有激活作用，其他金屬離子影響不大。

碎囊毛霉；β-1,3-1,4-葡聚糖酶；分離純化；酶學(xué)性質(zhì)

β-1,3-1,4-葡聚糖酶是β-葡聚糖水解酶系家族之一[1]。該酶廣泛存在于植物如大麥、燕麥、小麥、稻谷等作物，以及微生物[2-3]如細(xì)菌、真菌、瘤胃微生物和動 物中。

在食品和飼料工業(yè)等領(lǐng)域有廣泛使用[4]，如在飼料中添 加有利動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，從而提高生長性能和糧食的轉(zhuǎn)化率；將β-葡聚糖酶應(yīng)用于啤酒生產(chǎn)與制糖工業(yè)中可以提高產(chǎn)品品質(zhì)和出品率。傳統(tǒng)上工業(yè)使用的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的來源常以動植物提取為主，動植物來源的β-葡聚糖酶因其含量低，提取成本較高，不適于規(guī)模生產(chǎn)，而微生物酶具有不受生產(chǎn)季節(jié)和原料限制、生產(chǎn)周期短、便于工業(yè)化生產(chǎn)等特點(diǎn)，已逐步受到關(guān)注和青睞[5]。近年來，隨著高產(chǎn)酶菌株的獲得，采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)β-葡聚糖酶的研究已成為目前該領(lǐng)域的熱點(diǎn)[6-7]。已研究報道過的菌株，主要集中在芽孢桿菌屬（Bacillus）細(xì)菌及曲霉屬（Aspergillus）霉菌中，而有關(guān)毛霉屬（Mucor）真菌產(chǎn)β-葡聚糖酶菌株較為少見，對其酶學(xué)性質(zhì)方面研究及應(yīng)用于啤酒麥芽制造尚未見到相關(guān)報道。本研究室的趙志超等[8]從大麥表皮分離得到1株產(chǎn)β-葡聚糖酶的碎囊毛霉（Mucor petrinsularis）M-28菌株，已證明該菌株在微生物制麥方面具有良好的應(yīng)用前景和開發(fā)價值。因此，本實(shí)驗(yàn)擬采用碎囊毛霉為發(fā)酵菌株，以其固態(tài)培養(yǎng)基質(zhì)作為提取β-1,3-1,4-葡聚糖酶的原料，對其分離提取和純化工藝開展研究，并對該酶的部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，旨在探索出一套碎囊毛霉發(fā)酵法生產(chǎn)提取β-葡聚糖酶的工藝及參數(shù)，為其在微生物制麥工業(yè)中的開發(fā)應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)基

1.1.1 菌株與材料

碎囊毛霉M-28（Mucor petrinsularis），甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院微生物研究室分離保藏，分離于大麥表面[8]。

β-1,3-1,4-葡聚糖 美國Sigma公司；大麥 甘肅省武威市長城麥芽廠；麩皮 市售；Sephadex G-100 上海源葉生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。

固體產(chǎn)酶培養(yǎng)基[9]：大麥粉33%、麩皮67%、料水質(zhì)量比1∶1.2。

1.2 儀器與設(shè)備

VU756CRT型紫外-可見分光光度計、THZ-82臺式恒溫振蕩器 上海佑科儀器儀表有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱 北京科偉永興儀器有限公司；SW-CJ-1FD潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；TGL-10MC臺式高速冷凍離心機(jī) 長沙平凡儀器儀表有限公司；DYY-11型葡聚糖凝膠電泳儀 北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 β-1,3-1,4-葡聚糖酶浸提條件優(yōu)化

設(shè)定初始浸提條件為加入pH值5.5的乙酸-乙酸鈉（HAc-NaAc）緩沖液100 mL，移入振蕩器中200 r/min振蕩20 min，6 559×g離心10 min[9]。

1.3.1.1 不同pH值緩沖液對酶浸提的影響

將HAc-NaAc緩沖溶液分別配制為pH值3～7，加入固體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中再移入振蕩器中200 r/min進(jìn)行抽提測定酶活力，以最高酶活力為100%，確定其最佳pH值緩沖液。

1.3.1.2 浸提時間對酶浸提的影響

在固體培養(yǎng)基中加入HAc-NaAc緩沖液，移入振蕩器中200 r/min分別振蕩10、20、30、40、50、60 min，測定酶活力，以最高酶活力為100%，確定最佳浸提時間。

1.3.2 碎囊毛霉M-28產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的分離純化

1.3.2.1 粗酶液的提取

將碎囊毛霉接入PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)至長出孢子，用無菌水制備孢子懸濁液，調(diào)整孢子濃度107個/mL，接10%的孢子懸濁液于大麥粉和麩皮的培養(yǎng)基中26 ℃培養(yǎng)4 d，準(zhǔn)確量取100 mL pH 5.5值HAc-NaAc緩沖液倒入以發(fā)酵完畢的固態(tài)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，移入振蕩器中200 r/min振蕩30 min，再6 559×g離心10 min，所得上清液即為粗酶液。

1.3.2.2 酶活力測定

用pH 5.5的HAc-NaAc緩沖溶液將待測酶液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，取25 mL具塞刻度試管分別加入經(jīng)40℃ 預(yù)熱的酶稀釋液1.0 mL和經(jīng)40 ℃預(yù)熱的質(zhì)量濃度為1.0 g/100 mL的β-葡聚糖溶液1.0 mL，混勻，于40 ℃恒溫水浴準(zhǔn)確反應(yīng)10.0 min，后加入蒸餾水1.0 mL和DNS試劑3.0 mL，搖勻，置于沸水中準(zhǔn)確反應(yīng)5 min，取出并立即置于冰水浴中降至室溫，補(bǔ)水至25 mL混勻，以空白試管調(diào)零，在540 nm處比色，記錄其吸光度[10-12]。空白對照制作：吸取已稀釋酶液1.0 mL先加入DNS試劑3 mL，再加入蒸餾水1.0 mL和1.0 g/100 mL β-葡聚糖溶液1.0 mL，其他步驟同上。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得回歸方程Y= 2.868x－0.292 2（R2=0.999 8）。

酶活力定義：在40 ℃、pH 5.5條件下，每分鐘分解大麥β-葡聚糖產(chǎn)生1 μmol還原糖為1 個酶活力單位，以1 U/mL表示。

式中：x為540 nm波長處吸光度；n為酶液稀釋倍數(shù)；t為反應(yīng)時間/min。

1.3.2.3 蛋白質(zhì)濃度測定

考馬斯亮藍(lán)法：標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：稱取牛血清白蛋白25 mg，加水溶解定容至100 mL，吸取上述溶液40 mL，用蒸餾水稀釋至100mL即可。考馬斯亮藍(lán)試劑：考馬斯亮藍(lán)G-50 100mg溶于50 mL 95%乙醇，加入100 mL 85% H3PO4，用蒸餾水稀釋至1 000 mL，濾紙過濾備用。

取6 支試管，將試管分別編號成0、1、2、3、4、5，分別使6 支試管中的牛血清白蛋白含量達(dá)到0、20、40、60、80、100 μg，以0 號試管為空白在595 mn波長處測定各濃度的吸光度，以A595nm為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得回歸方程y=0.005 1x＋0.195 2（R2=0.999 3）。

1.3.2.4 酶分子質(zhì)量的測定

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）法。

1.3.2.5 硫酸銨鹽析實(shí)驗(yàn)

取8 份100 mL粗酶液，邊攪拌邊加入相應(yīng)質(zhì)量的硫酸銨，使其飽和度分別達(dá)到20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%。于4℃冰箱中靜置過夜，8300×g離心25 min。所得沉淀溶于20 mL pH5.5的HAc-NaAc緩沖溶液中，透析24 h后分別測定蛋白含量與酶活力[13-14]。

1.3.2.6 Sephadex G-100層析實(shí)驗(yàn)

取經(jīng)透析至無SO42－、用聚乙二醇濃縮的酶液10mL上Sephadex G-100柱進(jìn)行分離，收集酶活力組分。

1.3.2.7 酶純度檢驗(yàn)

采用SDS-PAGE方法[15]。

1.3.3 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)

1.3.3.1 最適溫度的確定

將純化后的純酶液稀釋至適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，加入相同濃度的底物，將酶反應(yīng)體系混合均勻后分別置于20～80 ℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)一段時間，以5 ℃為梯度，測定反應(yīng)液相對酶活力，以最高酶活力為100%[16]。

1.3.3.2 熱穩(wěn)定性的確定

將純化后的酶液稀釋至適當(dāng)倍數(shù)后分別置于40、45、50、55、60℃的恒溫水浴鍋中保溫，每隔10 min取樣，取出的樣品立即置于冰水浴中，于40 ℃反應(yīng)，測定相對酶活力，以最高酶活力為100%。

1.3.3.3 最適pH值的確定

將相同克數(shù)的底物溶解于pH3.0～8.0的HAc-NaAc緩沖液中，配制成不同pH值、相同濃度的底物溶液，在40 ℃反應(yīng)，測定相對酶活力，以最高酶活力為100%。

1.3.3.4 酸堿穩(wěn)定性的確定

用pH 3.0～8.0的HAc-NaAc緩沖液將純化后的酶液稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，混合均勻后，在40 ℃的恒溫水浴鍋中保溫1 h，立即取出后冰浴，測定相對酶活力，以最高酶活力為100%。

1.3.3.5 金屬離子對酶活力的影響

取純化后的酶液0.1 mL，加入0.4 mL不同濃度的金屬離子溶液和0.5 mL相同濃度的底物，使各金屬離子的最終濃度分別為1.0、10.0 mmol/L，然后于40 ℃反應(yīng)，測定相對酶活力，以不加任何金屬離子的反應(yīng)體系中酶活力為100%[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-1,3-1,4-葡聚糖酶浸提條件優(yōu)化

2.1.1 不同pH值緩沖液對酶浸提的影響

將配制成不同pH值的緩沖液加入發(fā)酵好的固態(tài)產(chǎn)酶培養(yǎng)基質(zhì)進(jìn)行浸提，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同pH值緩沖液對酶浸提的影響Fig.1 Effect of buffer pH on the recovery of the enzyme activity

由圖1可知，隨著緩沖液pH值的升高酶活力呈先上升后下降的趨勢，HAc-NaAc緩沖溶液在pH5.5時浸提β-1,3-1,4-葡聚糖酶得到的活力最高。說明碎囊毛霉M-28菌株產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的最適pH值為5.5，所以采用pH5.5的HAc-NaAc緩沖溶液作為最佳浸提液。

2.1.2 浸提時間對酶浸提的影響

在200r/min的振蕩器上浸提不同時間，結(jié)果如圖2所示。

圖2 浸提時間對酶浸提的影響Fig.2 Effect of extraction time on the recovery of the enzyme activity

由圖2可知，在10～30 min時，隨著時間的延長，酶活力呈增加趨勢，酶得率升高；當(dāng)浸提時間超過30 min時其酶活力基本保持不變，說明酶已被完全提出，延長時間后并不能提高酶活，所以酶的最佳抽提時間確定為30 min。

綜合圖1、2可知，碎囊毛霉M-28產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的最佳浸提條件為pH值5.5的HAc-NaAc緩沖液，200 r/min振蕩30 min，最終所得粗酶酶活力9.041 U/mL、蛋白質(zhì)含量為0.140 mg、酶比活力為64.583 U/mg。

2.2 碎囊毛霉M-28產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的分離純化

2.2.1 硫酸銨飽和度對β-1,3-1,4-葡聚糖酶純化效果的影響

采用硫酸銨飽和度為20%～90%，以10%為梯度，對碎囊毛霉M-28產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶進(jìn)行鹽析實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。隨著硫酸銨飽和度的增加，其沉淀中的酶活力也逐漸增大，當(dāng)飽和度達(dá)到80%時，其酶活力收率達(dá)到最大，進(jìn)一步提高硫酸銨飽和度時，其蛋白質(zhì)收率與酶活力收率均有下降，可能是硫酸銨飽和度過高使部分蛋白質(zhì)變性造成的。因此，確定鹽析純化碎囊毛霉M-28產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的最適硫酸銨飽和度為80%。

表1 硫酸銨飽和度對β-1,3-1,4-葡聚糖酶純化效果的影響Table1 Effect of ammonium sulfate saturation on the purification of β-1,3-1,4-glueaannaassee

2.2.2 Sephadex G-100層析對β-1,3-1,4-葡聚糖酶的純化效果

將鹽析沉淀的酶用pH 5.5的HAc-NaAc緩沖液溶解，再用透析袋透析24h，用聚乙二醇濃縮，取濃縮后的酶液10mL上Sephadex G-100層析柱，每隔5min收集1管，測定酶活力和可溶性蛋白，結(jié)果如圖3所示。

圖3 Sephadex G-100層析純化β-1,3-1,4-葡聚糖酶層析圖譜Fig.3 Chromatography of β-1,3-1,4- glueanase on Sephadex G-100 column

由圖3可知，洗脫液出現(xiàn)了2個蛋白峰，經(jīng)檢測第1個峰無酶活，為雜蛋白峰，第2個峰有酶活，為酶活峰。因此，需對該部分蛋白組分進(jìn)行純度檢測和酶學(xué)性質(zhì)研究。

2.2.3 SDS-PAGE測定β-1,3-1,4-葡聚糖酶分子質(zhì)量

收集經(jīng)Sephadex G-100層析分離純化的酶活力組分（13～18管），濃縮后采用SDS-PAGE進(jìn)行純度鑒定并測定酶蛋白的分子質(zhì)量，如圖4所示。

圖4 純化β-1,3-1,4-葡聚糖酶的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.4 SDS-PAGE of purified β-1,3-1,4-glucanase

由圖4可知，經(jīng)過Sephadex G-100凝膠過濾所得含酶組分在SDS-PAGE上呈單一條帶，說明經(jīng)以上步驟的純化，得到了電泳純的β-1,3-1,4-葡聚糖酶樣。由遷移率（x）與lgMr（y）的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=－1.0076x＋5.1523（R2=0.996）計算，樣品的遷移率為0.91，其分子質(zhì)量近似為17.2kD。

2.3 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

2.3.1 最適反應(yīng)溫度的確定

圖5 5 β-1,3-1,4-葡聚糖酶最適反應(yīng)溫度Fig.5 Effect of temperature on β-1,3-1,4- glucanase activity

由圖5可知，碎囊毛霉β-1,3-1,4-葡聚糖酶在50～55 ℃時酶活力較高，相對酶活力在90%以上，其反應(yīng)的最適溫度為55 ℃，超過55 ℃后酶活力迅速下降，當(dāng)溫度超過65 ℃時，酶完全失活。

2.3.2 酶的熱穩(wěn)定性

β-1,3-1,4葡聚糖酶在40～60 ℃，以5 ℃為梯度下保溫，測定酶活力在不同溫度下隨時間變化的情況，結(jié)果如圖6所示。

圖6 6 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性Fig.6 Thermo-stability of β-1,3-1,4-glucanase

由圖6可知，β-1,3-1,4葡聚糖酶在40、45、50 ℃條件下隨保溫時間延長，酶活力變化不大，相對比較穩(wěn)定；在55 ℃條件下隨著保溫時間的延長酶活力下降較明顯；而在60 ℃保溫10 min，相對酶活力僅為27.29%，繼續(xù)保溫酶失活。

2.3.3 酶最適pH值的確定

β-1,3-1,4葡聚糖酶與不同pH值底物于40 ℃反應(yīng)，以確定其最適pH值，結(jié)果如圖7所示。β-1,3-1,4葡聚糖酶在pH 4.0～5.5時酶活力較高，均在90%以上，最適pH值為5.5，pH值小于4或大于6 時酶活力呈現(xiàn)下降趨勢，當(dāng)pH值達(dá)到8時，其相對酶活力僅為30.96%。

圖7 7 β-1,3-1,4-葡聚糖酶最適pH值pHFig.7 Effect of pH value on β-1,3-1,4-glucanase activity

2.3.4 酶的酸堿穩(wěn)定性

采用不同pH值緩沖液稀釋β-1,3-1,4葡聚糖酶于40℃反應(yīng)，結(jié)果如圖8所示。

圖8 8 β-1 ,3-1,4葡聚糖酶的pH值穩(wěn)定性Fig.8 pH Stability of β-1,3-1,4-glucanase activity

由圖8可知，β-1,3-1,4葡聚糖酶在pH值4.0～5.5時酶活力較高，β-1,3-1,4葡聚糖酶在pH4.5～5.5時相對穩(wěn)定，說明該酶的酸堿穩(wěn)定性較差。

2.3.5 金屬離子對酶活力的影響

不同的金屬離子在濃度1 mmol/L和10 mmol/L下對β-1,3-1,4葡聚糖酶活力的影響，結(jié)果如表2所示。

表2 金屬離子對β-1 ,3-1,4-葡聚糖酶活力的影響Table2 Effect of differet metal ions on β--1,3-1,4- glucanase activity

由表2可知，1 mmol/L和10 mmol/L兩個離子濃度下Fe3+、Al3+對碎囊毛霉β-1,3-1,4葡聚糖酶具有明顯抑制作用，且Fe3+的抑制作用要比Al3+抑制作用強(qiáng)，F(xiàn)e3+作用下相對酶活力分別55.41%和40.78%，高濃度的Fe3+比低濃度的Fe3+抑制作用強(qiáng)；在1 mmol/L和10 mmol/L兩個離子濃度下Fe2+對β-1,3-1,4葡聚糖酶具有顯著激活作用，相對酶活力分別達(dá)到108.22%和198.92%；其他離子如Mg2+、Ca2+、Zn2+、Ba2+、K+對β-1,3-1,4葡聚糖酶的影響不大。

3 結(jié)論與討論

西北高海拔地區(qū)種植的啤酒大麥普遍存在著β-葡聚糖含量高、胚乳溶解困難且不均勻，制得的麥汁黏度大、過濾慢等缺點(diǎn)[18]，而目前針對這一問題的解決方法多采用外源酶解法，有關(guān)麥芽制備過程中添加酶法的研究已有報道，如劉妙蓮等[19]將來自枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的β-葡聚糖酶制劑添加于低發(fā)芽率麥芽的制汁過程中，發(fā)現(xiàn)可降低麥芽汁黏度，改善啤酒質(zhì)量。王云川等[20]曾報道過β-1,3葡聚糖酶制劑的在啤酒生產(chǎn)中應(yīng)用，能促進(jìn)胚乳細(xì)胞自溶、提高麥汁收率，同時協(xié)助酵母自溶。而本實(shí)驗(yàn)室通過前期的制麥菌株篩選及微生物制麥實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，添加碎囊毛霉M-28菌株作為制麥啟動子培養(yǎng)物能明顯改善高β-葡聚糖含量大麥在制麥過程的胚乳溶解性，已證明該菌株所產(chǎn)酶系在制麥方面存在一定的利用潛力和開發(fā)價值。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，碎囊毛霉M-28產(chǎn)β-葡聚糖酶的酶活力為9.041U/mL，雖在已報道的相關(guān)微生物源酶中活力不是很高，但已可以滿足高β-葡聚糖含量大麥在制麥過程中促進(jìn)胚乳溶解的需要，能夠通過有效降解麥芽中的β-葡聚糖來提高麥芽及麥汁的品質(zhì)。同時該菌株所產(chǎn)酶具有發(fā)酵周期短、培養(yǎng)基成分來源廣泛，提取工藝較為簡單等優(yōu)點(diǎn)。因此，開展碎囊毛霉M-28產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)研究，可以為工業(yè)化制麥提供酶制劑來源，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

另外，由酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果可知，該酶不能耐受較高溫度，但不影響其應(yīng)用于制麥過程。因?yàn)檎麄€制麥過程一般要求溫度控制在25 ℃以下，而該酶在此溫度條件下仍有較高活性，可以使用于制麥過程，有利于提高麥芽及啤酒的品質(zhì)。該酶酸堿穩(wěn)定性也較差，但制麥過程對pH值一般要求控制在6.0～6.5，而該酶在此pH值范圍酶活力較高。

本實(shí)驗(yàn)基于碎囊毛霉M-28固態(tài)發(fā)酵方式，對其所產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶開展了提取純化條件優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)研究，獲得了如下結(jié)論。

碎囊毛霉M-28產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的最佳浸提條件為pH 5.5的HAc-NaAc緩沖液、振蕩器轉(zhuǎn)速200 r/min、時間30 min，最終所得粗酶的酶活力9.041 U/mL，蛋白質(zhì)含量為0.140 mg/mL，酶比活力為64.583 U/mg。

所得粗酶，經(jīng)飽和度80%的硫酸銨鹽析，透析24 h濃縮處理，再經(jīng)Sephadex G-100柱凝膠過濾后，得到了電泳純酶，酶比活力達(dá)到225.02 U/mg，純度較粗酶液提高了2.48 倍。

該酶不能耐受較高的溫度，在40～50 ℃時相對穩(wěn)定，最適反應(yīng)溫度為55 ℃；酶活力在pH值4.5～5.5條件下相對穩(wěn)定，最適pH值為5.5；Fe3+和Al3+對其有抑制作用，F(xiàn)e2+對其有激活作用，其他金屬離子對其影響不大。

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Purification and Enzymatic Properties of β-1,3-1,4-Glucanase Produced by Mucor petrinsularis

DING Ye-mei, YUN Jian-min*, WEI Long, CHEN Fang, AI Dui-yuan, ZHANG Wen-wei
(College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

In the present study, we optimized the conditions for purifying β-1,3-1,4-glucanase produced by Mucor petrinsularis M-28 in solid-state fermentation, and characterized some enzymatic properties of the purif ed enzyme. The cultured medium was extracted with acetic acid-sodium acetate buffer at pH 5.5 by shaking at 200 r/min for 30 min and the crude enzyme extract was salted out with 80% saturated ammonium sulfate, dialyzed for 24 h, and chromatrographed on a Sephadex G-100 column. As a result, two protein peaks were obtained as determined by UV spectrophotometry. One of these was found to be enzymatically active. The pooled activity peak was highly concentrated using polyethylene glycol before being analyzed for purity by SDSPAGE. It turned out that the purif ed enzyme displayed a single protein band with a molecular weight of 17.2 kD. Its specif c activity was 225.02 U/mg, which was 3.48 times more active than the crude enzyme. The optimum temperature and pH for the enzyme activity were 40 ℃ and 6.0, respectively. The en zyme appeared to be stable at temperatures between 40 and 50 ℃ and in the pH range of 4.0–7.0, respectively. Both Fe3+and Al3+had obvious inhibitory effects on the enzyme. In contrast, Fe2+could obviously activate the enzyme, but other metal ions had a little impact.

Mucor petrinsularis; β-1,3-1,4 -glucanase; separation and purification; enzymatic properti es

TS262.5

A

1002-6630（2014）11-0143-06

10.7506/spkx1002-6630-201411029

2013-07-08

甘肅省科技重大專項(xiàng)計劃項(xiàng)目（1002NKDH029）；甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（1107RJZA128）

丁葉梅（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。E-mail：731376177@qq.com

*通信作者：贠建民（1968—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樯锕こ?。E-mail：yunjianmin@gsau.edu.cn