多黏類芽孢桿菌JSa-9電轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)化

高 玲，鄧 陽(yáng)，陸兆新，呂鳳霞，別小妹*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

多黏類芽孢桿菌JSa-9電轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)化

高 玲，鄧 陽(yáng)，陸兆新，呂鳳霞，別小妹*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

為建立多黏類芽孢桿菌JSa-9菌株的高效電擊轉(zhuǎn)化體系，本實(shí)驗(yàn)研究菌體培養(yǎng)時(shí)間、電場(chǎng)強(qiáng)度、電擊緩沖液、質(zhì)粒用量以及電擊后復(fù)蘇培養(yǎng)時(shí)間等因素對(duì)JSa-9菌株電轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果表明：Paenibacillus polymyxa JSa-9培養(yǎng)至OD595nm為0.3時(shí)，電轉(zhuǎn)化效率最高，為0.12×103CFU/μg DNA；用0.5 mol/L甘露醇、0.5 mol/L山梨醇以及10%甘油的電擊緩沖液洗滌細(xì)胞，在電場(chǎng)強(qiáng)度17.5 kV/cm、電阻200Ω，電容25 μF的電擊條件下，加入1.0 μg/100 mL質(zhì)粒DNA，復(fù)蘇培養(yǎng)時(shí)間18 h，電轉(zhuǎn)化效率達(dá)到約為0.36×103CFU/μg DNA；制備P. polymyxa JSa-9原生質(zhì)體，在電場(chǎng)強(qiáng)度5.0 kV/cm的電擊條件下，加入0.8 μg/100 mL質(zhì)粒DNA，電轉(zhuǎn)化效率較感受態(tài)電轉(zhuǎn)提高到約1.0×103CFU/μg DNA。

多黏類芽孢桿菌JSa-9；電轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)化效率

電轉(zhuǎn)化的效率高于化學(xué)方法制備感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率，而且所需設(shè)備簡(jiǎn)單，研究方法較方便、省時(shí)，是迄今為止將質(zhì)粒DNA導(dǎo)入芽孢桿菌的首選方法。目前已被成功的應(yīng)用于Bacillus subtilis、B. cereus、B. licheniformis、B. pseudofimus、Paenibacillus polymyxa等的轉(zhuǎn)化中[1-6]，但是由于不同菌株的生理生化特性、細(xì)胞壁構(gòu)造等的差異，轉(zhuǎn)化效率還因菌株而異。

1989年，Vehmaanper?[7]提出一種適用于芽孢桿菌如枯草芽孢桿菌和淀粉液化芽孢桿菌的電轉(zhuǎn)化方法。該法使用生長(zhǎng)培養(yǎng)基為L(zhǎng)BSP（LB含0.25 mol/L蔗糖和50 mmol/L鉀鹽緩沖液，pH 7.2），電擊洗液為SHMG（0.25 mol/L蔗糖含1 mmol/L HEPES，1 mmol/L MgCl2和10%甘油），恢復(fù)培養(yǎng)基是LBSPG（LBSP含10%甘油）。但該方法轉(zhuǎn)化效率很低，作為表達(dá)菌株是可以的，但作為建立分子基因庫(kù)則遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，所以Xue Gangping等[8]于1999年在上述方法的基礎(chǔ)上作出改進(jìn)，通過在電擊保護(hù)液中添加適量的高滲透劑如山梨醇和甘露醇，大大提高了轉(zhuǎn)化效率。前期的研究表明，多黏類芽孢桿菌JSa-9能產(chǎn)生兩大類抗菌脂肽LI-F和Polymyxin以及一種大分子抗菌糖蛋白，對(duì)細(xì)菌和真菌都具有廣譜的抑菌活性；在食品工業(yè)中，開發(fā)新型天然抗菌物質(zhì)將具有巨大應(yīng)用潛能。本實(shí)驗(yàn)通過將Paenibacillus polymyxa JSa-9培養(yǎng)到恰當(dāng)?shù)膶?duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，在電轉(zhuǎn)化過程中添加高滲透劑作為電擊保護(hù)液的基礎(chǔ)上摸索最適的P. polymyxa JSa-9的轉(zhuǎn)化條件以提高轉(zhuǎn)化效率的處理工藝。增加了電擊后的細(xì)胞存活率從而高效地使質(zhì)粒導(dǎo)入多黏類芽孢桿菌中，并能穩(wěn)定復(fù)制和傳遞，細(xì)胞存活率和電轉(zhuǎn)化效率均有很大程度的提高。為日后對(duì)菌株JSa-9進(jìn)行基因工程研究及提高其抗菌物質(zhì)產(chǎn)量提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

P. polymyxa JSa-9 本實(shí)驗(yàn)室分離并保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC4314）；質(zhì)粒pHT43德國(guó)MoBiTec公司，質(zhì)粒片段大小為8.1 kb，含有氯霉素抗性基因，氯霉素片段大小約為1.2 kb；重組質(zhì)粒PMD-spooA∷Cm和PMD-abrB∷Cm 本研究室前期構(gòu)建。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨1 g、酵母膏0.5 g、NaCl 1 g，蒸餾水100 mL，pH值調(diào)至7.0～7.2，121 ℃、20 min滅菌備用；生長(zhǎng)培養(yǎng)基：LB＋0.5 mol/L山梨醇；復(fù)蘇培養(yǎng)基：LB＋0.5 mol/L山梨醇＋0.38 mol/L甘露醇；高滲溶液SMM：蔗糖17.15 g、MgCl20.4273g、順丁烯二酸0.233 6 g，雙蒸水100 mL，pH 6.5，于115 ℃、30 min，滅菌備用；溶菌酶液：用SMM配制溶菌酶液，質(zhì)量濃度分別為10 mg/mL與50 mg/mL，再用孔徑為0.22 μm的無菌濾器過濾除菌，分裝成單次使用的小份，－20 ℃保存；再生培養(yǎng)基：牛肉膏 5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、葡萄糖 10.0 g、CaCl20.03 mol/L、MgCl20.02 mol/L、L-色氨酸0.2g/L、丁二酸鈉0.1 mol/L，蒸餾水1 000 mL，pH值調(diào)至7.0～7.2，于121℃、20 min滅菌備用。

1.3 試劑

UNIQ-10柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒、UNIQ-10柱式細(xì)菌基因組提取試劑盒、UNIQ-10柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒、UNIQ-10柱式膠回收試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；限制性內(nèi)切酶、連接酶 日本TaKaRa公司；氯霉素（4～5μg/mL） 美國(guó)Sigma公司。1.4 儀器與設(shè)備

凝膠成像系統(tǒng)、JS-380C全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析儀 上海培清科技有限公司；核酸水平電泳儀、MicroPulserTM電擊轉(zhuǎn)化儀、PowerPacTMHC；DYY-6B穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；高效液相色譜儀、Agilent 1100 Series（VWD檢測(cè)器） 美國(guó)Agilent公司；LNG-T88臺(tái)式快速離心濃縮干燥器 江蘇太倉(cāng)市華美生化儀器廠；UV-2450紫外-可見分光光度計(jì) 日本Shimadzu公司；WH-3微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠；JY98-III超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝科學(xué)儀器研究所；PTC-100TM和PTC-200TMPCR儀 MJ Research公司。

1.5 方法

1.5.1 感受態(tài)細(xì)胞的制備

將P. polymyxa JSa-9單菌落接入30 mL LB培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)20 h，然后按1∶30的比例轉(zhuǎn)接至30 mL生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)至一定濃度后，冰浴20 min使細(xì)菌停止生長(zhǎng)，4℃、5 000×g離心20 min收集菌體細(xì)胞，用預(yù)冷的電擊緩沖液洗滌菌體3 次，培養(yǎng)物懸浮于適量的電擊緩沖液中使得細(xì)胞濃度約為1.0×108個(gè)/mL。

1.5.2 JSa-9菌株的電擊轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證

取2 μL質(zhì)粒DNA（50 ng/μL）與50 μL冰冷的感受態(tài)細(xì)胞混勻，轉(zhuǎn)入至1 mm冰置電轉(zhuǎn)杯中，冰浴30 min后設(shè)定電擊參數(shù)電擊。電擊結(jié)束后立即加入1 mL復(fù)蘇培養(yǎng)基，菌液于30 ℃、120 r/min緩慢振蕩培養(yǎng)12 h后涂布于氯霉素抗性平板，培養(yǎng)24 h后觀察轉(zhuǎn)化子個(gè)數(shù)。

對(duì)含有氯霉素的LB平板上生長(zhǎng)的單菌落先進(jìn)行形態(tài)學(xué)判斷，然后隨機(jī)挑選形態(tài)上與JSa-9野生菌株一致的菌落接種于含氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)至OD600nm值約為0.6。用質(zhì)粒提取試劑盒從各轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)物中提取出質(zhì)粒，并將其作為模板，通過氯霉素抗性基因上下游引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增氯霉素抗性基因。擴(kuò)增產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析，如在約1 200 bp處出現(xiàn)目的條帶，則證明P. polymyxa JSa-9能在抗性平板上生長(zhǎng)是由于轉(zhuǎn)入氯霉素抗性基因所致；另外將提取得到的質(zhì)粒與原質(zhì)粒pHT43同時(shí)進(jìn)行電泳檢測(cè)，如二者條帶位置相同則進(jìn)一步證明質(zhì)粒pHT43已轉(zhuǎn)化入P. polymyxa JSa-9中，并且使其帶有氯霉素的篩選抗性。

PCR引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物：5’-ATGAACTTTAAT AAAATTGATTTAG-3’，下游引物：5’-TTATAAAAGCCAGTCATTAGGCC-3’。

1.5.3 JSa-9菌株不同生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

選擇不同生長(zhǎng)階段的P. polymyxa JSa-9培養(yǎng)物制成感受態(tài)細(xì)胞，采用含0.5 mol/L山梨醇、0.5 mol/L甘露醇、10%甘油的電擊緩沖液，電場(chǎng)強(qiáng)度17.5 kV/cm、電阻200 Ω、電容25 μF，進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。

1.5.4 不同電場(chǎng)強(qiáng)度和不同電阻值對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

電場(chǎng)強(qiáng)度過高會(huì)造成細(xì)胞的大量死亡，而電場(chǎng)強(qiáng)度過低則不能形成細(xì)胞穿孔。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定10、12.5、15、17.5、20、22 kV/cm電場(chǎng)強(qiáng)度下JSa-9菌株的電擊轉(zhuǎn)化效率。用前述優(yōu)化后的最適生長(zhǎng)時(shí)期的菌體做感受態(tài)細(xì)胞，采用含0.5 mol/L山梨醇、0.5 mol/L甘露醇、10%甘油的電擊緩沖液，電阻為200 Ω，電容25 μF，進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。

對(duì)芽孢桿菌的電擊轉(zhuǎn)化大多采用200 Ω[9]，也有報(bào)道采用400 Ω[10]。因此，本實(shí)驗(yàn)比較了200 Ω和400 Ω對(duì)JSa-9菌株電擊轉(zhuǎn)化效率的影響。用前述優(yōu)化后的最適生長(zhǎng)時(shí)期的菌體制備感受態(tài)細(xì)胞，采用含0.5 mol/L山梨醇、0.5 mol/L甘露醇、10%甘油的電擊緩沖液，電場(chǎng)強(qiáng)度為1750 V/cm、電容25 μF，進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。

1.5.5 電擊緩沖液和不同質(zhì)粒質(zhì)量濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，采用含0.5 mol/L山梨醇、0.5 mol/L甘露醇、10%甘油的電擊緩沖液能轉(zhuǎn)化成功，選擇前述已優(yōu)化的其他電擊條件，向基本電擊緩沖液中添加不同濃度的山梨醇和甘露醇，來研究電擊緩沖液對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響[10]。

Rittich等[11]報(bào)道了革蘭氏陽(yáng)性菌的電轉(zhuǎn)化效率與質(zhì)粒DNA質(zhì)量濃度的關(guān)系。因此，在已優(yōu)化的電擊條件下，用不同質(zhì)量濃度的質(zhì)粒DNA進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。

1.5.6 復(fù)蘇培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化

使用前述已獲得的最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件對(duì)復(fù)蘇培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，選取不同復(fù)蘇培養(yǎng)時(shí)間分別為3、6、9、12、16、18、20 h，進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。

1.5.7 原生質(zhì)體電轉(zhuǎn)化研究

取P. polymyxa JSa-9新鮮斜面接種于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng)22 h，取1.0 mL菌液轉(zhuǎn)入新鮮的30 mL液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)4～5 h，取8 mL菌液5 000 r/min離心10 min收集菌體，用SMM液洗滌2 次，用5 mL SMM重懸，加入溶菌酶液使酶終質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL，混合均勻，置于溫水浴中保溫酶解7 min，酶解結(jié)束后立即加入4 mL SMM稀釋，2 500 r/min離心10 min，用SMM液洗滌2次以清除酶液，將原生質(zhì)體懸浮于SMM中使得細(xì)胞濃度約為1.0×108個(gè)/mL。

取100 ?L原生質(zhì)體與8 ?L質(zhì)粒DNA（100 ng/?L）混勻放置5 min，加入電擊杯內(nèi)，設(shè)置電擊參數(shù)電擊。電擊完畢，加入600 ?L SMM，吸出培養(yǎng)液，30 ℃培養(yǎng)一定時(shí)間，涂布于含有氯霉素抗性的再生平板上30 ℃培養(yǎng)3 d，觀察轉(zhuǎn)化子數(shù)，計(jì)算轉(zhuǎn)化效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 P. polymyxa JSa-9的生長(zhǎng)曲線及細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

選擇不同生長(zhǎng)階段的P. polymyxa JSa-9培養(yǎng)物制成感受態(tài)細(xì)胞，在電場(chǎng)強(qiáng)度17.5 kV/cm、電阻200 Ω、電容25 μF的條件下進(jìn)行電擊。結(jié)果表明，不同種齡的菌體制成的感受態(tài)轉(zhuǎn)化率差別很大。由圖1可知，前2 h內(nèi)P. polymyxa JSa-9生長(zhǎng)緩慢，菌體的轉(zhuǎn)化效率幾乎為0；從3 h起，進(jìn)入生長(zhǎng)旺盛的對(duì)數(shù)期，當(dāng)OD595nm值為0.3時(shí)，菌體轉(zhuǎn)化效率最高，DNA的轉(zhuǎn)化效率約為0.12×103CFU/μg DNA；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化效率逐漸下降，當(dāng)OD595nm值為0.86時(shí)，此時(shí)菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，轉(zhuǎn)化效率已降至0，沒有得到轉(zhuǎn)化子。這可能是由于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期細(xì)胞生命力最旺盛，對(duì)電擊造成的損傷修復(fù)能力強(qiáng)，使得電擊后的細(xì)胞保持較高的存活率，因此相應(yīng)的轉(zhuǎn)化效率也高。然而，某些芽孢桿菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期或穩(wěn)定期才最適合電擊轉(zhuǎn)化，因?yàn)榇藭r(shí)期為芽孢形成前期，細(xì)胞壁較薄，容易接收外來DNA而發(fā)生遺傳轉(zhuǎn)化[12-13]。因此，有必要明確不同菌株轉(zhuǎn)化的最佳生長(zhǎng)時(shí)期。

圖1 不同生長(zhǎng)時(shí)期的多黏類芽孢桿菌JSa-9菌體細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.1 Effect of cell growth phase on transformation efficiency of P. polymyxa strain JSa-9

2.2 電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)JSa-9菌株電轉(zhuǎn)化效率的影響

圖2 不同電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)多黏類芽孢桿菌JSa-9菌株電轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.2 Effect of electric field intensity on transformation efficiency of P. polymyxa strain JSa-9

電場(chǎng)強(qiáng)度是影響電擊轉(zhuǎn)化效率的又一重要參數(shù)[14-15]。不同電場(chǎng)強(qiáng)度下JSa-9菌株的電擊轉(zhuǎn)化效率測(cè)定結(jié)果如圖2所示，在低場(chǎng)強(qiáng)時(shí)（如10 kV/cm和12.5 kV/cm），轉(zhuǎn)化效率低于0.1×103CFU/μg DNA；當(dāng)場(chǎng)強(qiáng)為17.5kV/cm時(shí)，細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最高，轉(zhuǎn)化效率為0.19×103CFU/μg DNA；但是，若進(jìn)一步升高電場(chǎng)強(qiáng)度至22 kV/cm時(shí)，感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率降至0。由于P. polymyxa JSa-9屬于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞壁厚，場(chǎng)強(qiáng)低時(shí)轉(zhuǎn)化效率低，而過高的場(chǎng)強(qiáng)雖可以增強(qiáng)外源基因進(jìn)入菌體細(xì)胞的機(jī)率，但同時(shí)也會(huì)增加細(xì)菌細(xì)胞的死亡概率，使得轉(zhuǎn)化效率下降。因此，最佳的轉(zhuǎn)化效率需要同時(shí)兼顧這兩方面。

2.3 不同電阻值對(duì)JSa-9菌株電轉(zhuǎn)化效率的影響

圖3 電阻值200 Ω（A）和440000 Ω（B）對(duì)多黏類芽孢桿菌JSaa--99菌株電轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.3 Effect of electric resistance on transformation efficiency of P. polymyxa strain JSa-9

測(cè)試電阻值在200 Ω和400 Ω條件下JSa-9菌株的電擊轉(zhuǎn)化效率，結(jié)果見圖3，在電阻值為200 Ω和400 Ω的條件下獲得的電轉(zhuǎn)化效率差別不大，200 Ω時(shí)的轉(zhuǎn)化效率達(dá)到0.13×103CFU/μg DNA，略高于400 Ω時(shí)的0.1×103CFU/μg DNA。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)電擊過程采用200 Ω電阻值。

2.4 電擊緩沖液對(duì)JSa-9菌株電轉(zhuǎn)化效率的影響

表1 不同電擊緩沖液對(duì)多黏類芽孢桿菌JSa-9菌株電轉(zhuǎn)化效率的影響Table1 Effect of electroporation buffer on transformation efficiency ooff P. polymyxa strain JSSaa--99

選擇前述已優(yōu)化的最佳電擊條件，向基本電擊緩沖液中添加不同濃度的山梨醇和甘露醇，來研究電擊緩沖液對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響[5,8,16-18]。前期用0.625 mol/L蔗糖作為電擊緩沖液，轉(zhuǎn)化效率為0.12×103CFU/μg DNA。表1結(jié)果表明，用甘油作為電擊緩沖液時(shí)，未得到轉(zhuǎn)化子；當(dāng)加入0.5 mol/L的山梨醇或甘露醇時(shí)，轉(zhuǎn)化率略有提高；當(dāng)山梨醇及甘露醇以等濃度（均為0.5 mol/L）加入時(shí)，電轉(zhuǎn)化效率最高，為0.21×103CFU/μg DNA，高于只加入蔗糖的電擊緩沖液條件。因此，確定電擊緩沖液的最佳組成為0.5 mol/L甘露醇、0.5 mol/L山梨醇以及10%甘油。由于用高滲透溶液作為電擊緩沖液來洗滌菌體細(xì)胞，可以降低細(xì)胞表面的離子強(qiáng)度；還可以平衡菌體內(nèi)高的膨壓，減少了電擊時(shí)高場(chǎng)強(qiáng)對(duì)細(xì)胞的損傷，提高了細(xì)胞的存活率，從而提高轉(zhuǎn)化效率。

2.5 質(zhì)粒DNA質(zhì)量濃度對(duì)JSa-9菌株電轉(zhuǎn)化效率的影響

在已優(yōu)化的電擊條件下，用不同濃度的質(zhì)粒DNA進(jìn)行電擊，以得到最高的電轉(zhuǎn)化效率，結(jié)果見圖4。在0.5～1.0 μg/100 μL的質(zhì)粒質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，適當(dāng)?shù)靥岣哔|(zhì)粒DNA的質(zhì)量濃度可以提高多黏類芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化效率，轉(zhuǎn)化效率最高為0.3×103CFU/μg DNA；但是，當(dāng)質(zhì)粒DNA質(zhì)量濃度繼續(xù)升高時(shí)，轉(zhuǎn)化效率反而降低。如當(dāng)質(zhì)粒質(zhì)量濃度為2.0 μg/100 μL時(shí)，轉(zhuǎn)化效率僅為最高轉(zhuǎn)化效率的30%；若質(zhì)粒質(zhì)量濃度進(jìn)一步升高至3.0 μg/100 μL時(shí)，將不能獲得轉(zhuǎn)化子。

圖4 不同質(zhì)粒質(zhì)量濃度對(duì)多黏類芽孢桿菌JSa-9菌株電轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.4 Effect of plasmid DNA concentration on transformation efficiency of P. polymyxa strain JSa-9

2.6 陽(yáng)性克隆子的篩選鑒定

圖5 質(zhì)粒pHT43P. polymyxa JSa-9轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證Fig.5 Confirmation of the transformants from P. polymyxa JSa-9

為驗(yàn)證電擊轉(zhuǎn)化P. polymyxa JSa-9后得到的轉(zhuǎn)化子，隨機(jī)選擇5株轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒進(jìn)行篩選鑒定。電泳結(jié)果顯示，所提取的質(zhì)粒與質(zhì)粒pHT43帶型大小均完全一樣（圖5A）。再以提取得到的質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增氯霉素抗性基因序列，結(jié)果表明這些質(zhì)粒DNA均能擴(kuò)增得到1 200 bp的氯霉素抗性基因（圖5B）。因此，抗性平板上生長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子均為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，質(zhì)粒pHT43成功轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，使得野生型P. polymyxa JSa-9菌株獲得氯霉素抗性。

2.7 復(fù)蘇培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化

圖6 復(fù)蘇培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株JSa-9電轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.6 Effect of recovery time on transformation efficiency of P. polymyxa strain JSa-9

本實(shí)驗(yàn)使用前述已獲得的最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件對(duì)復(fù)蘇培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，由圖6可知，復(fù)蘇培養(yǎng)時(shí)間僅為3～9 h內(nèi)，均不能獲得轉(zhuǎn)化子；當(dāng)復(fù)蘇培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至12 h，抗性平板上出現(xiàn)一定數(shù)量的轉(zhuǎn)化子，但篩選鑒定表明，其中只有約60%的轉(zhuǎn)化子為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，電轉(zhuǎn)化效率為0.12×103CFU/μg DNA；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)轉(zhuǎn)化效率隨之提高，當(dāng)培養(yǎng)至18 h時(shí)獲得最高轉(zhuǎn)化效率，約為12 h時(shí)的3 倍；而再延長(zhǎng)復(fù)蘇培養(yǎng)時(shí)間反而使得轉(zhuǎn)化效率有所降低。

2.8 原生質(zhì)體電轉(zhuǎn)化的研究

圖7 電場(chǎng)強(qiáng)度（A）和質(zhì)粒質(zhì)量濃度（B）對(duì)多黏類芽孢桿菌JSa-9菌株原生質(zhì)體電轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.7 Effects of electric field intensity (A) and plasmid DNA concentration (B) on transformation efficiency of P. polymyxa strain JSa-9 protoplasts

推測(cè)革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁厚，密度高，很難被擊穿以使大分子通過膜穿孔進(jìn)入細(xì)胞中。因此，企圖通過去除細(xì)胞壁，制備P. polymyxa JSa-9原生質(zhì)體進(jìn)行電轉(zhuǎn)，從而提高轉(zhuǎn)化效率。不同電場(chǎng)強(qiáng)度下JSa-9菌株原生質(zhì)體的電擊轉(zhuǎn)化效率測(cè)定結(jié)果如圖7A所示，原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化率隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的升高逐漸降低；在電場(chǎng)強(qiáng)度為5 kV/cm時(shí)，原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最高，轉(zhuǎn)化效率為1.25×103CFU/μg DNA；當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度升高到15 kV/cm或更高時(shí)，原生質(zhì)體的的轉(zhuǎn)化效率降至0。

在最適的電場(chǎng)強(qiáng)度5 kV/cm條件下，用不同質(zhì)量濃度的質(zhì)粒DNA進(jìn)行電擊，以得到最高的電轉(zhuǎn)化效率，結(jié)果見圖7B。在0.5～1.2 μg/100 mL的質(zhì)粒質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，適當(dāng)?shù)靥岣哔|(zhì)粒DNA的質(zhì)量濃度可以提高多黏類芽孢桿菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化效率，當(dāng)質(zhì)粒DNA的質(zhì)量濃度為0.8 μg/100 mL時(shí)，轉(zhuǎn)化效率最高為1.0×103CFU/μg DNA；但是，當(dāng)質(zhì)粒DNA質(zhì)量濃度繼續(xù)升高時(shí)，轉(zhuǎn)化效率反而降低。

利用上述原生質(zhì)體電轉(zhuǎn)條件，能夠?qū)⑽覀儤?gòu)建的重組質(zhì)粒（PMD-spooA∷Cm和PMD-abrB∷Cm）轉(zhuǎn)入P. polymyxa JSa-9中，結(jié)果如圖8所示，在電場(chǎng)強(qiáng)度為5.0 kV/cm時(shí)，重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率分別為0.37×103CFU/μg DNA和0.25×103CFU/μg DNA，重復(fù)實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)化效率較為穩(wěn)定。

圖8 不同的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化多黏類芽孢桿菌JSa-9原生質(zhì)體Fig.8 Effect of recombinant plasmid on transformation efficiency of P. polymyxa strain JSa-9 protoplasts

圖9 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化P. polymyxaJSa-9轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證Fig.9 Confirmation of the transformants from P. polymyxa JSa-9

為驗(yàn)證電擊轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體P. polymyxa JSa-9后得到的轉(zhuǎn)化子，隨機(jī)選擇3～4株P(guān)CR擴(kuò)增重組質(zhì)粒攜帶的氯霉素抗性基因序列，結(jié)果如圖9所示，從4株轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增重組質(zhì)粒PMD-spooA∷Cm攜帶的氯霉素抗性基因序列，2株得到1 200 bp的氯霉素抗性基因，2株為假陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子；從3 株轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增重組質(zhì)粒PMD-abrB∷Cm攜帶的氯霉素抗性基因序列，3 株均能得到1 200 bp的氯霉素抗性基因。

3 討 論

電轉(zhuǎn)化法是用高壓脈沖電流擊破細(xì)胞膜或在細(xì)胞膜表面擊出小孔，從而使外源基因通過這些小孔進(jìn)入細(xì)胞[19]。影響微生物細(xì)胞電轉(zhuǎn)化效率的因素主要有細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況、電擊緩沖液組成、電場(chǎng)強(qiáng)度、質(zhì)粒質(zhì)量濃度等[8]。

另外，以往文獻(xiàn)研究芽孢桿菌電轉(zhuǎn)化條件時(shí)，采用的電擊后菌液復(fù)蘇培養(yǎng)時(shí)間通常為3～6h，而Murray等[20]在轉(zhuǎn)化1株P(guān). larvae時(shí)，通過延長(zhǎng)復(fù)蘇時(shí)間有效地提高了轉(zhuǎn)化效率。本研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)延長(zhǎng)電擊后復(fù)蘇培養(yǎng)時(shí)間可提高轉(zhuǎn)化效率，但同時(shí)也出現(xiàn)一定量的非陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子?？赡艿脑蚴怯捎谳^長(zhǎng)時(shí)間的復(fù)蘇培養(yǎng)使得菌體在氯霉素誘導(dǎo)下逐漸獲得一定的抗性，而非質(zhì)粒pHT43成功轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞。優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果顯示，電擊后復(fù)蘇培養(yǎng)17 h涂抗性平板可獲得最高的轉(zhuǎn)化效率，約為0.5×103CFU/μg DNA。

革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌比陰性菌的電轉(zhuǎn)化效率要低，究其原因仍然沒有確切的證明，推測(cè)可能是革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁比陰性菌細(xì)胞壁厚，密度高，更難被擊穿以使大分子通過膜穿孔進(jìn)入到細(xì)胞中。從增加電場(chǎng)強(qiáng)度并且保護(hù)細(xì)胞存活這兩方面來越過此瓶頸從而提高轉(zhuǎn)化效率。2009年，莫靜燕等[21]通過酶解法對(duì)地衣芽孢桿菌工業(yè)生產(chǎn)菌株Bacillus licheniformis 303原生質(zhì)體的制備及再生條件進(jìn)行研究，在此條件下，采用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）法將游離型質(zhì)粒pHY-P43-secQ轉(zhuǎn)化宿主菌B.licheniformis 303，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)10～15 CFU/μg DNA。

但是，在已知的范圍還少有針對(duì)野生型多黏類芽孢桿菌進(jìn)行原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化研究的報(bào)道。因此，在已建立的P. polymyxa JSa-9高效電擊轉(zhuǎn)化體系的研究基礎(chǔ)上。本實(shí)驗(yàn)仍以P. polymyxa JSa-9為研究對(duì)象，結(jié)合已有的原生質(zhì)體制備和再生的條件，針對(duì)pHT43目的質(zhì)粒，建立了P. polymyxa JSa-9原生質(zhì)體電轉(zhuǎn)化體系，電轉(zhuǎn)效率可達(dá)到1.25×103CFU/μg DNA，是制備感受態(tài)細(xì)胞直接電轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)化效率的2.5倍，并且能夠?qū)?gòu)建的重組質(zhì)粒（PMD-spooA∷Cm和PMD-abrB∷Cm）轉(zhuǎn)入P. polymyxa JSa-9中，轉(zhuǎn)化效率穩(wěn)定，為今后對(duì)菌株JSa-9進(jìn)行基因工程研究及提高其抗菌物質(zhì)產(chǎn)量提供支持。

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Optimization of Electroporation Conditions for Paenibacillus polymyxa JSa-9

GAO Ling, DENG Yang, LU Zhao-xin, Lü Feng-xia, BIE Xiao-mei*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

To establish an electrotransformation method for Paenibacillus polymyxa strain JSa-9, the effec ts of different factors on the transformation efficiency of strain JSa-9 by electroporation were explored by evaluating cell growth phase, electric field intensity, electroporation buffer, plasmid DNA contentation and recovery time. The results showed that a transformation efficiency of 0.12 × 103CFU transformants per μg DNA was achieved when P. polymyxa JSa-9 cell culture reached an OD595nmof 0.3. Under the conditions of 17.5 kV/cm, 200 Ω and 25 μF for electric field strength, electric resistance and capacitance, respectively, the electroporation efficiency was roughly 0.5 × 103transformants per μg DNA when adding 1.0 μg/100 mL of plasmid DNA to an electroporation buffer containing 0.5 mol/L sorbitol, 0.5 mol/L mannitol, and 10% glycerol and recovering for 17 h. Moreover, the transformation efficiency of P. polymyxa JSa-9 protoplasts was increased to approximately 1.0 × 103CFU transformants per μg DNA under electric field strength of 5.0 kV/cm upon addition of 0.8 μg/100 mL plasmid DNA.

Paenibacillus polymyxa JSa-9; electroporation; transformation efficiency

Q785

A

1002-6630（2014）11-0089-06

10.7506/spkx1002-6630-201411018

2013-05-28

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31271828）；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAD23B05）

高玲（1990—），女，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：2008108010@njau.edu.cn

*通信作者：別小妹（1964—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锛吧锛夹g(shù)。E-mail：bxm43@njau.edu.cn