脫氫醋酸鈉對斷奶仔豬抗氧化能力的影響

屈長波，王 恬*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

脫氫醋酸鈉對斷奶仔豬抗氧化能力的影響

屈長波，王 恬*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

研究食品添加劑脫氫醋酸鈉對動物抗氧化能力的影響。以仔豬作為實(shí)驗(yàn)動物模型，選用10日齡哺乳仔豬（杜×長×大）192頭，隨機(jī)分成4組（每組4個重復(fù)，每重復(fù)12 頭），飼喂不含脫氫醋酸鈉的基礎(chǔ)日糧（對照組）、基礎(chǔ)日糧中分別添加脫氫醋酸鈉0.02%（實(shí)驗(yàn)組Ⅰ）、0.1%（實(shí)驗(yàn)組Ⅱ）和0.2%（實(shí)驗(yàn)組Ⅲ）的日糧，實(shí)驗(yàn)期42 d。結(jié)果表明：與對照組相比，1）仔豬51 d體質(zhì)量，Ⅲ組顯著降低13.26%（P＜0.05），Ⅰ、Ⅱ組無顯著差異（P＞0.05）；2）Ⅲ組仔豬血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力極顯著降低（P＜0.01），總抗氧化能力（tota l antioxidant capacity，T-AOC）顯著降低（P＜0.05），而Ⅰ、Ⅱ組仔豬血清抗氧化指標(biāo)均無顯著差異（P＞0.05）；3）仔豬肝臟丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，除Ⅲ組外，Ⅰ（P＜0.01）、Ⅱ（P＜0.05）組均有明顯升高。因此，日糧中添加0.2%脫氫醋酸鈉，明顯降低仔豬的抗氧化能力，食品中使用高劑量脫氫醋酸鈉存在一定的健康風(fēng)險。

脫氫醋酸鈉；斷奶仔豬；抗氧化能力

脫氫醋酸鈉（又名脫氫乙酸鈉）（sodium dehydroacetate）對霉菌、細(xì)菌和酵母菌有很強(qiáng)的抑制能力[1]，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織（Food and Agriculture Organization，F(xiàn)AO）和世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）認(rèn)可的一種安全型食品防霉、防腐保鮮劑。在日本，脫氫醋酸鈉被添加在奶酪、黃油、面包等食品中，其法定最高添加量為0.05%[2]，我國食品添加劑標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會在1998年已將脫氫醋酸列為食品添加劑新品種[3]，由于高劑量脫氫醋酸鈉可能存在一定的潛在危害性，我國將其列為限量使用的添加劑[4]。由于人與動物的生長發(fā)育過程中，存在許多環(huán)境因素都能引起機(jī)體自由基的過量生成，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，而人與動物的抗氧化防御體系與健康存在著密切的關(guān)系[5]。在本實(shí)驗(yàn)室開展對脫氫醋酸鈉防霉功能的前期研究基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)以仔豬作為實(shí)驗(yàn)動物模型，進(jìn)一步探討脫氫醋酸鈉對仔豬抗氧化功能的影響，為脫氫醋酸鈉作為食品添加劑的科學(xué)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及日糧

選用健康的體質(zhì)量接近的杜×長×大三元雜交哺乳仔豬192頭（平均體質(zhì)量為（3.57±0.42）kg），公母各半，參照美國國家研究委員會（National Research Council，NRC）仔豬營養(yǎng)需要配制日糧。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，實(shí)驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)日糧中加入0.02%、0.1%和0.2%的脫氫醋酸鈉。基礎(chǔ)日糧組成見表1。

表1 斷奶仔豬實(shí)驗(yàn)日糧組成及營養(yǎng)水平Table1 Ingredients and nutrient levels of the diet for weaned piglets

1.2 試劑與儀器

脫氫醋酸鈉（C8H7NaO4，產(chǎn)品純度99.8%） 江蘇天成動物保健公司；谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛、超氧化物歧化酶、總抗氧化能力等抗氧化指標(biāo)試劑盒 江蘇南京建成生物工程研究所。

DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；TECAN InfiniteTM M200多功能熒光酶標(biāo)儀 上海寶特生命科學(xué)有限公司；5804R高速臺式冷凍離心機(jī)德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計與飼養(yǎng)管理

選自24窩的10日齡杜×長×大三元雜交哺乳仔豬192頭（平均體質(zhì)量為（3.57±0.42）kg），按遺傳基礎(chǔ)一致性原則，分別將來自各同窩的8頭隨機(jī)分為4組，最終分成每組48 頭。每組再隨機(jī)分4 個重復(fù)（每個重復(fù)12 頭，公母各半）。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧（日糧中不含脫氫醋酸鈉），Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組為實(shí)驗(yàn)組（分別在基礎(chǔ)日糧中加入0.02%、0.1%和0.2%的脫氫醋酸鈉），實(shí)驗(yàn)期42 d。實(shí)驗(yàn)豬自由采食，自動飲水器供水，每天早晚各清糞一次，每天飼喂4 次（7：00、11：00、15：00、18：00），免疫程序按常規(guī)方法進(jìn)行。仔豬10、23、35、51d時，對其進(jìn)行空腹稱質(zhì)量并記錄體質(zhì)量與耗料。

1.3.2 樣品采集

在仔豬51 d時，分別從每個重復(fù)隨機(jī)選1 頭仔豬前腔靜脈采血，靜置10～15 min后，3 500 r/min離心5 min，取上清液，置于－20 ℃冰箱貯藏待測。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，每個重復(fù)隨機(jī)選1頭仔豬，共16 頭仔豬，經(jīng)頸部放血致死，取肝臟樣品液氮罐保存待測。

1.3.3 樣品處理與測定

10%肝臟組織組織勻漿液制備方法：取肝臟組織0.5 g，按質(zhì)量比1∶9加入預(yù)冷的生理鹽水，在冰水浴中勻漿破碎1～2min，組織勻漿液3 500r /min離心15 min，取上清液于－20 ℃冰箱保存待測。谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）采用還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）氧化法測定，超氧化物歧化酶（SOD）采用黃嘌呤氧化法測定，總抗氧化能力（T-AOC）采用Fe3+還原法測定，丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定。上述指標(biāo)均按南京建成生物工程研究所試劑盒說明書測定。

1.3.4 肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察

取肝右葉組織置于10%中性甲醛液中固定，石蠟包埋、切片，HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)學(xué)變化情況。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2010處理后，采用SPSS17.0軟件中的One-Way ANOVA 進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著性用Duncan法進(jìn)行組間多重比較，數(shù)據(jù)均以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫氫醋酸鈉對斷奶仔豬體質(zhì)量的影響

表2 不同水平脫氫醋酸鈉對斷奶仔豬體質(zhì)量的影響Table2 Effects of dietary supplementation of sodium dehydroacetate on body weight in weaned piglets

由表2可知，仔豬35日齡平均體質(zhì)量，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組較對照組分別降低了1.11%、1.51%、7.39%，但均未達(dá)到生物統(tǒng)計顯著性標(biāo)準(zhǔn)（P＞0.05）；仔豬51日齡平均體質(zhì)量，Ⅰ、Ⅱ組較對照組降低了2.58%、4.83%，差異均不顯著（P＞0.05），Ⅲ組較對照組顯著降低了13.26%（P＜0.05）。

2.2 脫氫醋酸鈉對斷奶仔豬血清抗氧化功能的影響

表3 脫氫醋酸鈉對斷奶仔豬血清抗氧化功能指標(biāo)的影響Table3 Effects of dietary supplementation of sodium dehydroacetate on serum antioxidative indices in weaned piglets

由表3可知，與對照組相比較，Ⅲ組仔豬血清SOD活力極顯著降低（P＜0.01），T-AOC顯著降低（P＜0.05）。Ⅰ、Ⅱ組仔豬血清抗氧化指標(biāo)與對照組比較均無顯著變化（P＞0.05）。血清MDA含量，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組較對照組差異均不顯著（P＞0.05）。

2.3 脫氫醋酸鈉對斷奶仔豬肝臟抗氧化功能的影響

表4 脫氫醋酸鈉對斷奶仔豬肝臟抗氧化功能的影響Table4 Effects of dietary supplementation of sodium dehydroacetate on hepatic antioxidative indices in weaned piglets

由表4可知，與對照組相比，Ⅰ組仔豬肝臟MDA含量極顯著升高（P＜0.01），Ⅱ組顯著升高（P＜0.05），III組無顯著變化（P＞0.05）。GSH-Px、SOD、T-AOC等抗氧化指標(biāo)，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組較對照組均無顯著變化（P＞0.05）。

2.4 脫氫醋酸鈉對斷奶仔豬肝臟組織形態(tài)的影響

圖1 肝臟病理切片（×100）Fig.1 Pathological section images of liver (×100)

由圖1可知，Ⅲ組肝臟組織中央靜脈和門管區(qū)嚴(yán)重充血；Ⅰ、Ⅱ組與對照組比較無顯著變化。

3 討 論

3.1 脫氫醋酸鈉對斷奶仔豬體質(zhì)量的影響

國外關(guān)于脫氫醋酸鈉的毒性實(shí)驗(yàn)已經(jīng)有較多研究[6-7]。有研究報道稱在小鼠的飼料中加入0.1%～0.2%劑量的脫氫醋酸，105 d后，小鼠沒有出現(xiàn)任何中毒現(xiàn)象，但是小鼠的體質(zhì)量增加遲緩；猴子每千克體質(zhì)量飼喂0.018%添加量的脫氫醋酸鈉，每周5 次，經(jīng)過一年以上未見損害，但是當(dāng)添加量為0.02%時會引起生長紊亂和器官的病理變化[3]。豬作為實(shí)驗(yàn)動物模型在人類醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用已十分普遍[8-9]，本實(shí)驗(yàn)采用仔豬作為動物模型的研究結(jié)果顯示，隨著日糧中脫氫醋酸鈉添加量的增加，仔豬51 日齡平均體質(zhì)量有逐漸降低的趨勢，日糧中添加脫氫醋酸鈉達(dá)0.2%時，51 日齡仔豬體質(zhì)量降低明顯（P＜0.05），表明脫氫醋酸鈉添加量不宜過高，這與Zhang Yumei等[3]的研究結(jié)果一致。另外，Sakaguchi等[10]研究表明，脫氫醋酸鈉會導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量減輕和腸道出血，并進(jìn)一步提出這可能是由于脫氫醋酸鈉導(dǎo)致小鼠體內(nèi)缺乏VK引起的。本實(shí)驗(yàn)中脫氫醋酸鈉明顯降低了仔豬體質(zhì)量，而且在解剖仔豬時發(fā)現(xiàn)高劑量脫氫醋酸鈉添加組仔豬肝臟組織充血，這也與Sakaguchi等[10]的研究結(jié)果一致，其具體的生物學(xué)機(jī)制尚待進(jìn)一步探究。

3.2 脫氫醋酸鈉對斷奶仔豬抗氧化功能的影響

正常情況下，動物機(jī)體都存在一個完整的抗氧化系統(tǒng)，當(dāng)動物在應(yīng)激狀態(tài)下機(jī)體抗氧化酶活性降低，消除氧化代謝產(chǎn)物的能力下降[11-13]。超氧化物歧化酶（SOD）能有效清除自由基，減輕自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對機(jī)體的損害[14]。總抗氧化能力（T-AOC）的大小反應(yīng)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)對外來刺激的代償能力以及機(jī)體自由基代謝的狀況，是衡量機(jī)體抗氧化系統(tǒng)功能狀況的綜合性指標(biāo)[15]。有學(xué)者指出脫氫醋酸鈉會很快地被人或者動物機(jī)體吸收，并分布在血漿和各個器官中，有抑制多種酶的作用[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著脫氫醋酸鈉添加量的增加，仔豬血清SOD活力有先升高后降低的趨勢，T-AOC有逐漸降低的趨勢，特別是，0.2%脫氫醋酸鈉添加組仔豬的血清SOD比對照組極顯著降低（P＜0.01），T-AOC顯著降低（P＜0.05），MDA含量升高（P＜0.05），表明日糧中添加高劑量脫氫醋酸鈉會降低仔豬血清抗氧化酶活力，這一結(jié)果也支持駱萌的觀點(diǎn)[16]，當(dāng)脫氫醋酸鈉進(jìn)入仔豬腸道后很可能被迅速吸收，并抑制多種抗氧化酶活性，仔豬的抗氧化系統(tǒng)被破壞，抵御外來刺激的能力也下降，健康水平受到嚴(yán)重威脅。

MDA是自由基作用于生物膜中的不飽和脂肪酸產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物，其含量常常可以反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映出細(xì)胞損傷的程度，也可以間接反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度[17]。Sugihara等[18]研究了脫氫醋酸鈉等4種常用防霉劑對正常培養(yǎng)的大鼠肝臟細(xì)胞MDA含量的影響，結(jié)果顯示這4種防霉劑均沒有增加肝臟細(xì)胞MDA含量。這提示脫氫醋酸鈉可能并不直接造成肝臟組織氧化損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組比較，0.02%與0.1%兩個添加量實(shí)驗(yàn)組的仔豬肝臟MDA含量均升高，這與Sugihara的研究結(jié)果不一致。這可能是因?yàn)榕c體外培養(yǎng)細(xì)胞相比，動物體內(nèi)的代謝環(huán)境比較復(fù)雜，脫氫醋酸鈉在動物體內(nèi)有可能代謝為其他產(chǎn)物發(fā)揮負(fù)面作用[19]。也有可能是脫氫醋酸鈉導(dǎo)致仔豬體內(nèi)缺乏VK，間接地影響了仔豬的正常代謝，從而造成肝臟的氧化損傷[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，隨著脫氫醋酸鈉添加量的增加，仔豬肝臟MDA含量有降低的趨勢，這可能是因?yàn)楫?dāng)脫氫醋酸鈉達(dá)到一定劑量后，一部分脫氫醋酸鈉發(fā)揮了抑制或延緩肝臟氧化損傷的作用。國外有研究表明，脫氫醋酸鈉對于小鼠并沒有致畸性和致癌性，并有抑制肝癌發(fā)生或延緩的作用[20]。在國內(nèi)目前還沒有關(guān)于脫氫醋酸鈉對肝臟抗氧化功能影響的詳細(xì)研究報道，特別是在本實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上繼續(xù)增加脫氫醋酸鈉添加量梯度組別，進(jìn)一步延長實(shí)驗(yàn)期，進(jìn)一步研究其對人和動物抗氧化功能的影響與添加量上限十分有必要。脫氫醋酸鈉對機(jī)體抗氧化功能影響的作用機(jī)理尚須進(jìn)一步深入研究，以便為食品添加劑脫氫醋酸鈉的科學(xué)應(yīng)用，提供更加翔實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究表明日糧中添加0%～0.2%脫氫醋酸鈉時，隨著脫氫醋酸鈉的劑量的增加，仔豬體質(zhì)量和總的抗氧化能力逐漸降低。因此食品中添加高劑量的脫氫醋酸鈉存在一定的健康風(fēng)險。

[1] 段會軻, 周輝. 脫氫醋酸鈉復(fù)合保鮮在低溫肉食品中的應(yīng)用[J]. 肉類工業(yè), 2008(9): 14-16.

[2] UCHIDA O, NAITO K, YASUHARA K, et al. Studies on the acute oral toxicity of dehydroacetic acid, sorbic acid and their combination compound in rats[J]. Eisei Shikenjo hōkoku. Bulletin of National Institute of Hygienic Sciences, 1985, 103: 166-171.

[3] ZHANG Yumei, DU Yufeng, YIN Jun, et al. Determination and depletion of dehydroacetic acid residue in chicken tissues[J]. Food Additives & Contaminants: Part A, 2012, 29(6): 918-924.

[4] 李青, 白梅, 蔣素, 等. 脫氫乙酸在食品中殘留量檢測方法的研究進(jìn)展[J]. 中國衛(wèi)生工程學(xué), 2009, 8(2): 116-117.

[5] 馬玉娥, 占秀安, 朱巧明, 等. 飼糧色氨酸水平對黃羽肉種雞生產(chǎn)性能, 抗氧化功能及血清生化指標(biāo)的影響[J]. 動物營養(yǎng)學(xué)報, 2011, 23(12): 2177-2182.

[6] SPENCER H C, ROWE V K, MCCOLLISTER D D. Dehydroacetic acid (DHA) I. acute and chronic toxicity[J]. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 1950, 99(1): 57-68.

[7] SEEVERS M H, SHIDEMAN F E, WOODS L A, et al. Dehydroacetic acid (DHA) II. General pharmacology and mechanism of action[J]. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 1950, 99(1): 69-83.

[8] 趙斌. 小型豬在口腔牙周醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用[J]. 口腔醫(yī)學(xué)研究, 2013, 29(2): 194-196.

[9] 張賀, 王承利, 王洋, 等. 小型豬動物模型在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的研究應(yīng)用[J].中國畜牧獸醫(yī), 2012, 39(7): 263-266.

[10] SAKAGUCHI Y, SUGA S, OSHIDA K, et al. Anticoagulant effect of sodium dehydroacetate (DHA-S) in rats[J]. Journal of Applied Toxicology, 2008, 28(4): 524-529.

[11] VALAVANIDIS A, VLAHOGIANNI T, DASSENAKIS M, et al. Molecular biomarkers of oxidative stress in aquatic organisms in relation to toxic environmental pollutants[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2006, 64(2): 178-189.

[12] MIGLIORE L, COPPEDE F. Environmental-induced oxidative stress in neurodegenerative disorders and aging[J]. Mutation Research/ Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 2009, 674(1): 73-84.

[13] 劉顯軍, 楊營, 邊連全, 等. 日糧ω6/ω3 多不飽和脂肪酸構(gòu)成比對育肥豬背最長肌脂肪酸組成和血清抗氧化指標(biāo)的影響[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(1): 272-276.

[14] MEDEIROS M H G, WEFERS H, SIES H. Generation of excited species catalyzed by horseradish peroxidase or hemin in the presence of reduced glutathione and H2O2[J]. Free Radical Biology and Medicine, 1987, 3(2): 107-110.

[15] 趙林, 黃新華. 創(chuàng)傷與機(jī)體總抗氧化能力的關(guān)系初探[J]. 實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志, 2003, 7(1): 82-84.

[16] 駱萌. 脫氫醋酸及其相關(guān)化合物生產(chǎn)技術(shù)[J]. 化工中間體: 科技產(chǎn)業(yè)版, 2004, 1(7): 31-32.

[17] 張勇, 汪儆, 林東康. 苜?？傔皩θ庾须u抗氧化性能的影響[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2007, 34(11): 11-15.

[18] SUGIHARA N, SHIMOMICHI K, FURUNO K. Cytotoxicity of food preservatives in cultured rat hepatocytes loaded with linolenic acid[J]. Toxicology, 1997, 120(1): 29-36.

[19] 彭武厚. 脫氫醋酸的合成及其在食品方面的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)[J]. 化學(xué)世界, 1983, 24(5): 137-139.

[20] ACID D. Final report on the safety assessment of sodium dehydroacetate and dehydroacetic acid[J]. International Journal of Toxicology, 1985, 4(3): 123-159.

Effects of Sodium Dehydroacetate on Antioxidant Capacity in Weaned Piglets

QU Chang-bo, WANG Tian*
(College of Animal Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

The effects of sodium dehydroacetate on antioxidant capacity in weaned piglets were investigated. A total of 192 crossbreds (Duroc × Landrace × Yorkshire) piglets at 10 days of age were randomly divided into 4 groups with 4 replicates consisting of 12 animals each. They were weaned and fed with basal diet (control group), basal diet supplemented with 0.02% (group Ⅰ), 0.1% (group Ⅱ) and 0.2% (group Ⅲ) sodium dehydroacetate, respectively. The experiment lasted for 42 days. The results showed that when comparing with the control group: 1) the weight of the 51-day-old piglets in group Ⅲwas signif cantly decreased by 13.26% (P ＜ 0.05), while groups Ⅰ and Ⅱ had no signif cant difference (P ＞ 0.05); 2) the serum total superoxide dismutate (T-SOD) in group Ⅲ was decreased highly signif cantly (P ＜ 0.01), in addition to a signif cant reduction in serum total antioxidant capacity (T-AOC) (P ＞ 0.05). But the serum antioxidant indices in groups Ⅰand Ⅱ had no significant difference; and 3) the liver malondialdehyde (MDA) contents in groups I (P ＜ 0.01) and Ⅱ(P ＜ 0.05) but not in group Ⅲ were increased signif cantly. These results indicate that the diet containing 0.2% sodium dehydroacetate could signif cantly decrease the TAC in piglets. Thus some potential health risks may be caused by using high levels of sodium dehydroacetate in food.

sodium dehydroacetate; weaned piglets; antioxidant capacity

TS202.3

A

1002-6630（2014）11-0054-04

10.7506/spkx1002-6630-201411011

2013-10-15

江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目

屈長波（1988—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)閯游餇I養(yǎng)與飼料科學(xué)。E-mail：changboqu@163.com

*通信作者：王恬（1958—），男，教授，博士，研究方向?yàn)閯游餇I養(yǎng)與飼料科學(xué)。E-mail：twang18@163.com