單鏈環(huán)狀DNA添加劑抑制基因表達(dá)序列分析Ditag聚合酶鏈反應(yīng)引物多聚體生成

劉玉慧，劉星，劉學(xué)東，鄭冬

(東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040)

單鏈環(huán)狀DNA添加劑抑制基因表達(dá)序列分析Ditag聚合酶鏈反應(yīng)引物多聚體生成

劉玉慧，劉星，劉學(xué)東，鄭冬*

(東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040)

［目的］研究利用單鏈環(huán)狀DNA抑制聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)副產(chǎn)物的作用效果。［方法］設(shè)計(jì)并合成單鏈環(huán)狀DNA，并以具同樣序列發(fā)卡狀結(jié)構(gòu)的單鏈DNA為對(duì)照組，在基因表達(dá)序列分析(SAGE)Ditag PCR反應(yīng)中加入上述不同濃度的DNA，利用電泳技術(shù)檢測不同結(jié)構(gòu)(環(huán)狀/單鏈)以及不同濃度單鏈DNA對(duì)PCR多聚體附產(chǎn)物的抑制作用。［結(jié)果］發(fā)卡狀結(jié)構(gòu)的單鏈DNA無法抑制PCR引物多聚體副產(chǎn)物的產(chǎn)生;而在70～150 nmol/L終濃度范圍內(nèi)，單鏈環(huán)狀DNA可以抑制SAGE Ditag PCR反應(yīng)中引物多聚體的生成，并且不影響SAGE不同tag間的表達(dá)豐度差異。［結(jié)論］單鏈環(huán)狀DNA可以作為PCR反應(yīng)中引物多聚體生成的有效抑制劑。

單鏈環(huán)狀DNA(sscDNA);系列基因表達(dá)分析(SAGE);引物多聚體;抑制

隨著基因測序技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，許多模式物種和高等動(dòng)物(如人)的基因組全序列的信息被一一破譯。然而，基因組計(jì)劃的研究成果只能從結(jié)構(gòu)水平說明基因的組成特征和序列信息;從功能水平來如何解讀這些基因調(diào)控和相互作用成為后基因組時(shí)代一個(gè)亟待解決的問題［1］。例如，人大約有30 000個(gè)基因，但是大約只有20%的基因在同一時(shí)間被表達(dá)?；虮磉_(dá)的時(shí)空性已經(jīng)引起廣泛的關(guān)注。針對(duì)此問題，各種組學(xué)(Omics)水平的技術(shù)方法和理論應(yīng)運(yùn)而生的。其中從轉(zhuǎn)錄水平闡明在特定時(shí)間和空間節(jié)點(diǎn)中基因組表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)是近年來一個(gè)熱點(diǎn)研究領(lǐng)域［2］。

目前常用的研究基因差異表達(dá)的試驗(yàn)方法有很多種。常見的有mRNA差顯RTPCR法(mRNA differential display RT-PCR，mRNA DDRT-PCR)、消減雜交(subtractive hybridization)等［3］。然而這些方法信息容納量不足，僅能反映有限基因的表達(dá)水平，不能很好地揭示那些大量未知基因的表達(dá)水平。1995年美國Johns Hopkins大學(xué)的Velculescu等首先提出了系列基因表達(dá)分析(Serial analysis of gene expression，SAGE)技術(shù)，用于基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜的分析。SAGE技術(shù)［4］的出現(xiàn)是組學(xué)研究上的一個(gè)重要里程碑，該技術(shù)能同時(shí)定量分析實(shí)驗(yàn)對(duì)象的成千上萬個(gè)轉(zhuǎn)錄本，克服了以前很多技術(shù)存在的缺陷，還能很靈敏地檢測出那些低豐度表達(dá)的基因。SAGE技術(shù)已經(jīng)從純粹的基因差異表達(dá)研究拓展到重要基因功能研究、醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)理論研究、疾病的診斷和治療等很多領(lǐng)域，并取得了諸多顯著的成果［5］。

眾所周知，理論上一個(gè)9個(gè)堿基的短核苷酸序列標(biāo)簽?zāi)軌蚍直?62 144個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄物(49)，而人類基因組估計(jì)僅能編碼約80 000種轉(zhuǎn)錄物，因此一個(gè)SAGE tag包含有足夠的信息能夠確認(rèn)唯一一種轉(zhuǎn)錄物。在實(shí)際運(yùn)用中，SAGE技術(shù)始終在不斷改進(jìn)和發(fā)展。以其中Long SAGE為例，其采用特定的錨定酶能獲得約17 bp的SAGE標(biāo)簽(tag)來特異性地確定mRNA轉(zhuǎn)錄物，然后利用酶將每2個(gè)tag連接形成ditag，進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，再將酶切后的將多個(gè)ditag標(biāo)簽(20～60個(gè))隨機(jī)串聯(lián)形成大量的多聯(lián)體(concatemer)并克隆到載體中;經(jīng)測序并應(yīng)用SAGE軟件分析，可確定表達(dá)的基因種類，并可根據(jù)標(biāo)簽出現(xiàn)的頻率確定基因的表達(dá)豐度［6］。由于SAGE是一個(gè)高度敏感系統(tǒng)，可用于低豐度序列的確定。目前該技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于很多疾病相關(guān)新基因的發(fā)現(xiàn)，以及細(xì)胞或組織的基因表達(dá)譜的研究。

近年來，試驗(yàn)嘗試?yán)肧AGE技術(shù)研究鹿茸再生過程中基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的時(shí)空變化動(dòng)態(tài)。在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，對(duì)SAGE ditag進(jìn)行PCR擴(kuò)增過程中有大量引物多聚體出現(xiàn)。由于PCR擴(kuò)增SAGE ditag是SAGE技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，通過這一步既要保證各tag能反映原始表達(dá)豐度的差異，同時(shí)還要獲得足夠量的DNA用于下游酶切反應(yīng);而引物多聚體對(duì)實(shí)現(xiàn)上述實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)產(chǎn)生了極大地干擾。Brownie等曾研究通過設(shè)計(jì)新型引物來抑制PCR引物多聚體試驗(yàn)方案［7］。由于這將涉及對(duì)Ditag兩端接頭序列進(jìn)行較大改動(dòng)，而且需要2次PCR擴(kuò)增，這顯然不符合SAGE技術(shù)中關(guān)于保持表達(dá)豐度的基本原則。但是這個(gè)技術(shù)方法有一個(gè)啟示:既然具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的引物能夠增加PCR目標(biāo)產(chǎn)物的特異性合成，能否設(shè)計(jì)具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的單鏈DNA作為添加劑來抑制PCR引物多聚體的產(chǎn)生呢?筆者針對(duì)這個(gè)設(shè)想開展試驗(yàn)研究，以期為該技術(shù)的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SV Total RNA Isolation System，購自Promega公司;Long SAGE文庫構(gòu)建試劑盒，購自Invitrogen公司;SYBR Premix ExTaq試劑盒、Agarose ms-6、Agarose LM SIEVE，Ex taq和hot-start taq DNA polymerase，均購自Takara公司;單鏈DNA寡聚核苷酸(C1:GCGGGCGGCG CAAAAAAGCG CCGCCCGC和C2:CCCGCAAAAA AGCGGGCGGC GCAAAAAAGC GCCG)添加物、STAT1引物(S1:TGGGGCACAA GGTGACAG和S2:TCACTCTTCTGTGTTCACTTACACTTCA)以及人GAPDH實(shí)時(shí)定量PCR引物(HG1:AGAAGGCTGG GGCTCATTTG和HG2:AGGGGCCATC CACAGTCTTC)，均由上海英駿公司合成與純化，其中C1通過復(fù)性形成發(fā)卡結(jié)構(gòu);C2通過連接形成單鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

1.2 鹿茸上皮組織總RNA的提取 取鹿茸新鮮上皮組織30mg，放入1.5 ml離心管中。根據(jù)SV Total RNA Isolation System試劑盒試驗(yàn)手冊(cè)，加入RNA Lysis Buffer后，將組織勻漿，進(jìn)行總RNA的提取。用紫外分光光度計(jì)測定RNA在260和280 nm的OD值，計(jì)算濃度與純度。取其中10μl總RNA和15μl甲酰胺65℃、5 min處理后迅速放到冰上冷卻2 min。再利用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳分析總RNA的完整性。將獲得的總RNA分裝，保存于－70℃?zhèn)溆?。其他總RNA保存于－70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SAGE文庫Ditag制備 根據(jù)Long SAGE文庫構(gòu)建試劑盒相關(guān)試驗(yàn)手冊(cè)。取100μl oligo(dT)磁珠置于1.5 ml離心管中，在磁座上對(duì)oligo(dT)磁珠進(jìn)行清洗2次后，將準(zhǔn)備好的100μg RNA與磁珠進(jìn)行充分混合。隨后室溫靜置30 min，在磁座上吸附2 min，移去上清液;再用1×First Strand Buffer清洗4次，去除上清液;然后加入87μl cDNA一鏈合成液(18.0 μl 5 × First Strand Buffer;1.0 μl RNaseOUT;54.5 μl DEPC 水;9.0 μl0.1mol/LDTT;4.5 μl dNTPMix)，37 ℃溫育1 h進(jìn)行cDNA第1鏈的合成。接著加入660μl cDNA 2鏈合成液(465μl DEPC Water;150μl 5×Second Strand Buffer;15 μl dNTPMix;5 μlE.coliDNA Ligase;20 μlE.coliDNA Polymerase;5μlE.coliRNase H)，16℃溫育反應(yīng)2 h后置于冰上，并加入45μl0.5mol/L EDTA終止反應(yīng)。接著加入750μlWash Buffer C 75℃溫育12 min，滅活E.coliDNA Polymerase。在磁座上靜置2min，移去上清液，用Wash Buffer D洗脫4次。最后，吸去上清，加入200μl 1×Buffer 4，搖勻。

在磁座上靜置2 min后，去除上清，將磁珠懸浮于200μl NlaⅢ酶切溶液中(172μl LoTE;2μl 100×BSA;20μl 10×Buffer 4;6μl NlaⅢ)，37℃溫育1 h后，將反應(yīng)液在磁座上靜置2min，吸去上清液，用750μlWash Buffer C洗脫并滅活酶的活性，再用Wash Buffer D洗脫磁珠4次。用150μl 1×Ligase Buffer洗脫2次，隨后用100μl 1×Ligase Buffer懸浮磁珠，等量分成A、B管。

將上述2管溶液靜置在磁座上2 min，小心移去上清液，逐步加入接頭連接液(1.5μl Adapter A或B(20 ng/μl);14.0 μl LoTE;2.0 μl 10×Ligase Buffer);50 ℃加熱2 min，室溫冷卻15 min，放置于冰上。隨后加入2.5μl T4 DNA連接酶，16℃溫浴2 h。每1管都分別用500μlWash Buffer D洗脫4次，再用1×Buffer4洗2次，將磁珠懸浮在1×Buffer4溶液中。

將上面得到的2管溶液靜置在磁座上2min后移去上清液。加入含有標(biāo)簽酶的反應(yīng)液(70μl LoTE;10μl 100×SAM;10μl10×Buffer4);37℃溫浴2min，平衡反應(yīng)液，加入10μl標(biāo)簽酶MmeI，37℃溫浴1 h，反應(yīng)結(jié)束后，在磁座上靜置2 min，小心吸取上清液，分別保存于新的2個(gè)離心管中。利用酚－氯仿及乙醇沉淀法處理所得到的樣品，分別用4μl LoTE溶解沉淀。將上述2管溶液混合，加入連接酶及反應(yīng)液，37℃溫浴30 min后。利用酚/氯仿及乙醇沉淀法處理所得到的Ditag，最后的沉淀顆粒溶解在14μl LoTE溶液中。

1.4 SAGE Ditag的擴(kuò)增 將連接產(chǎn)物40倍作為PCR擴(kuò)增模板，進(jìn)行Ditag PCR反應(yīng)。試驗(yàn)每個(gè)反應(yīng)體系(50μl)組成均如下:5 μl 10 × PCR buffer，3 μl DMSO，5 μl dNTP，0.5 UTaqDNA聚合酶，SAGE上下游引物各2μl。其他反應(yīng)成分如不同濃度單鏈DNA添加劑和DNA或cDNA模板因試驗(yàn)不同目的不同均為1μl或用等體積水補(bǔ)足。PCR反應(yīng)條件為:2min，95 ℃進(jìn)行變性;94 ℃，30 s;55 ℃，1 min;70 ℃，1 min;共計(jì)27個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增;最后70℃延伸5min。所有試驗(yàn)均設(shè)陰性和/或陽性對(duì)照組。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用4%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 單鏈環(huán)狀DNA添加劑可抑制引物多聚體 試驗(yàn)使用SAGE文庫構(gòu)建試劑盒中的引物進(jìn)行ditag擴(kuò)增時(shí)，引物可自身產(chǎn)生2個(gè)以上的清楚可見的多聚體DNA帶，雖然使用試劑盒附帶的熱啟動(dòng)DNA聚合酶，但是無法抑制上述副產(chǎn)物的產(chǎn)生(圖1A)，這將影響ditag目的帶的擴(kuò)增效率。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其中一條引物多聚體帶與真正的130 bp ditag帶非常接近，對(duì)于ditag帶切膠回收具有干擾。合成單鏈DNA中，具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的C2對(duì)于引物多聚體具明顯抑制作用，且呈濃度依賴型。結(jié)果顯示，其抑制效用在終濃度75～150 nmol/L最佳(圖1B);而具發(fā)卡結(jié)構(gòu)的C1對(duì)于引物多聚體均無明顯抑制效果(圖1C)。

2.2 單鏈環(huán)狀DNA C2對(duì)DNA聚合酶濃度的影響 以篩選出來的C2的最佳濃度為基準(zhǔn)，利用已經(jīng)成功建立的STAT1的基因擴(kuò)增體系研究DNA聚合酶濃度與C2的相關(guān)性，結(jié)果顯示，無論是Hot-start DNA聚合酶還是普通DNA聚合酶，在含有C2的PCR體系中，最低終濃度不得少于0.025 U/μl(圖1D)。

圖1 利用單鏈環(huán)狀DNA添加物抑制引物多聚體

2.3 單鏈環(huán)狀DNA C2對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)量的影響 利用實(shí)時(shí)定量PCR來研究單鏈環(huán)狀DNA C2是否會(huì)影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)量，通過比較含有或不含有C2的不同反應(yīng)體系的Ct平均值，結(jié)果顯示兩者無顯著差異(圖1E)，說明單鏈環(huán)狀DNA C2的添加對(duì)PCR產(chǎn)物影響不顯著(P＞0.05)。

3 結(jié)論與討論

由于部分引物多聚體副產(chǎn)物與Ditag目的片段長度非常接近，不僅影響目的產(chǎn)物的產(chǎn)量，同時(shí)在經(jīng)過DNA膠回收及后續(xù)處理步驟后，在導(dǎo)致測得的序列中將獲得大量的未知序列，有可能被誤判讀成新SAGE tag。引物多聚體的出現(xiàn)顯示，作為SAGE技術(shù)中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，Ditag接頭序列和PCR引物在設(shè)計(jì)上存在很大的缺陷。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)的單鏈DNA添加物C1和C2主要序列和結(jié)構(gòu)上非常相似，只是C2是一個(gè)封閉的單鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，而C1呈一端開放性的發(fā)卡結(jié)構(gòu)。但是試驗(yàn)顯示，發(fā)卡結(jié)構(gòu)的單鏈DNA添加物C1無法抑制Ditag PCR中引物多聚體的產(chǎn)生;而C2對(duì)于引物多聚體的抑制呈現(xiàn)濃度依賴性的特點(diǎn)(圖1B、C)。上述結(jié)果對(duì)于多種普通或熱啟動(dòng)DNA聚合酶具有一致性(數(shù)據(jù)未附)。雖然C2添加劑可以抑制引物副產(chǎn)物的產(chǎn)生，但是在試驗(yàn)篩選出來的濃度范圍內(nèi)，C2不會(huì)降低特異性產(chǎn)物的產(chǎn)量，這個(gè)結(jié)論利用定量PCR試驗(yàn)給予了進(jìn)一步證實(shí)。單鏈環(huán)狀DNA添加物C2不僅可以用于SAGE試驗(yàn)，其實(shí)對(duì)于常規(guī)的PCR試驗(yàn)中引物副產(chǎn)物的抑制也有作用，但是其最佳使用終濃度需要進(jìn)一步篩選和優(yōu)化。

目前，用于PCR反應(yīng)的DNA聚合酶種類和來源有很大不同，但是在結(jié)構(gòu)具有相似性［8－11］。試驗(yàn)認(rèn)為引物多聚體的產(chǎn)生是伴隨PCR試驗(yàn)、卻同時(shí)獨(dú)立于其他目的片段擴(kuò)增的過程，僅與引物和聚合酶有關(guān)。因此，從僅含有DNA聚合酶和引物的陰性對(duì)照試驗(yàn)就可以發(fā)現(xiàn)，這也為研究引物多聚體的產(chǎn)生提供了一個(gè)優(yōu)良的體系。試驗(yàn)雖然發(fā)現(xiàn)了C2添加物抑制PCR引物多聚體的現(xiàn)象，但是對(duì)其機(jī)理還是不甚清楚。一個(gè)可能的解釋是，C2能夠優(yōu)先有效地競爭性占據(jù)DNA聚合酶上對(duì)于引物多聚體形成具有關(guān)鍵性的功能域，從而抑制引物多聚體的形成。其具體分子機(jī)理尚需要進(jìn)一步研究。

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Using Single Strand Circular DNA Additive to Inhibit Primer PolymersGenerated during Ditag PCR of Serial Analysisof Gene Expression

LIU Yu-hui，ZHENG Dong et al (Northeast Forestry University，Harbin，Heilongjiang 150040)

［Objective］To investigate the hypothesis thatusing single strand DNA asadditive to preventmispriming productof PCR.［Method］We designed and synthesized two kinds of single strand DNA additives;one was circular and another hairpin-like.Different concentrations of each kind of DNA additiveswere added into Ditag PCR systems of Long Serial Analysis of Gene Expression.Final productswere used for gel electrophoresis to screen DNA additives structure-or concentration-dependent inhibition of PCR primer polymer.［Results］Single strand circular buthairpin-like DNA additiveswas able to inhibit PCR primer polymer;the optimal final concentration was between 70 and 150 nmol/L，and single strand circular DNA additiveswill notaffect differential expression of SAGE tags.［Conclusion］Single strand circular DNA can be used as effective inhibitor to prevent primer polymers in PCR amplification.

Single strand circular DNA(sscDNA);Serial analysis of gene expression(SAGE);Primer polymers;Inhibition

S188

A

0517－6611(2014)15－04576－03

黑龍江省博士后科研啟動(dòng)資助金(項(xiàng)目編號(hào):LBH-Q07009);中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(項(xiàng)目編號(hào):2572014EA05)。

劉玉慧(1989－)，女，黑龍江哈爾濱人，碩士研究生，研究方向:分子細(xì)胞生物學(xué)。*通訊作者，教授，從事分子細(xì)胞生物學(xué)研究。

2014-04-29