響應(yīng)面法優(yōu)化酶輔助閃式提取二氫槲皮素工藝

柴 婧，付警輝，張衛(wèi)鵬，鄭毅男，劉文叢

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

響應(yīng)面法優(yōu)化酶輔助閃式提取二氫槲皮素工藝

柴 婧，付警輝，張衛(wèi)鵬，鄭毅男，劉文叢*

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

目 的：利用響應(yīng)面法對(duì)纖維素酶輔助閃式提取二氫槲皮素的工藝條 件進(jìn)行優(yōu)化。方法：以二氫槲皮素的提取率為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)影響提取率的條件（乙醇體積分?jǐn)?shù)、加酶量和液料比）進(jìn)行 優(yōu)化。結(jié)果：最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)60.93%、加酶量3.48 mg/g、液料比103.64：1（mL/g）、提取時(shí)間120 s。結(jié)論：閃式提取操作簡(jiǎn)便、節(jié)能、省時(shí)，可應(yīng)用于二氫槲皮素大規(guī)模生產(chǎn)。

長(zhǎng)白落葉松；二氫槲皮素；纖維素酶；閃式提??；響應(yīng)面分析法

二氫槲皮素又名花旗松素、紫杉葉素、黃杉素、雙氫櫟精等，化學(xué)名為5,7,3’,4’-四羥基二氫黃酮醇，分子式為C15H12O7，相對(duì)分子質(zhì)量為304.25。二氫槲皮素廣泛存在于落葉松、水紅花、刺玫薔薇等60 余種植物當(dāng)中[1-2]，其具有很多生物學(xué)活性，如抗病毒[3]、抗氧化[4]、抗癌、抑制惡性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[5]、調(diào)節(jié)酶活性[6]、防曬美白[7]、治療惡性淋巴細(xì)胞病變[8]等，因此被廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化妝品、工業(yè)、農(nóng)業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域[9]。

大部分植物的細(xì)胞壁都是纖維素構(gòu)成，其有效成分往往被包裹在細(xì)胞壁內(nèi)。纖維素酶廣泛的應(yīng)用于植物的提取工藝中，它可以破壞植物的細(xì)胞壁，使構(gòu)成植物細(xì)胞壁等不易利用的植物纖維分解成葡萄糖，從而有利于有效成分從植物中溶出[10-12]。閃式提取法是應(yīng)用閃式提取器，利用植物組織破碎原理從而使有效成分從植物體中大量溶出的一種提取方法，具有快速、簡(jiǎn)便、不需加熱等特點(diǎn)，可以節(jié)約大量的時(shí)間和能源，適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)[13-15]。

目前，落葉松中二氫槲皮素的提取方法及工藝優(yōu)化主要有浸漬法[16]、回流提取法[17]、有機(jī)溶劑萃取法[18-20]、超聲提取法[21]、微波輔助提取法[22-23]、沉淀分離法[24-25]等，每種提取方法都存在著各自的優(yōu)缺點(diǎn)。而用纖維素酶預(yù)處理后采用閃式提取長(zhǎng)白落葉松中二氫槲皮素的方法鮮有研究。本研究以長(zhǎng)白落葉松為原料，用纖維素酶預(yù)處理后，用閃式提取器提取長(zhǎng)白落葉松中的二氫槲皮素，采用響應(yīng)面分析法，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，對(duì)提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

落葉松取材于吉林省臨江市，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)鄭毅男教授鑒定為松科（Pinaceae）落葉松屬（Larix）植物長(zhǎng)白落葉松（Larix olgensis Henry var. koreana Nakai）。二氫槲皮素對(duì)照品（≥87.5%） 美國(guó)Sigma公司；乙醇、甲酸（均為分析純） 北京化工廠；甲醇（色譜純） 美國(guó)Tedia公司；纖維素酶 廣州蘇柯漢微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JHBE-50S閃式提取器 河南金鼎科技有限公司；BP211D型電子天平 德國(guó)Sartorius公司；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FW400A高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 北京科偉永興儀器有限公司；LC-2010A高效液相色譜儀（配有LC solution工作站、SPD-20A紫外檢測(cè)器） 日本島津公司；SZ-93自動(dòng)雙重水蒸餾器 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 二氫槲皮素高效液相色譜檢測(cè)方法

1.3.1.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取二氫槲皮素對(duì)照品50 mg，用甲醇-水（2：3，V/V）定容于50 mL容量瓶中，分別移取0.5、1、4、6、8、10 mL對(duì)照品溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇-水（2：3）定容至刻度，得質(zhì)量濃度分別為0.044、0.088、0.35、0.525、0.7、0.875 mg/mL的對(duì)照品溶液。

1.3.1.2 供試品溶液的制備

取過(guò)30 目篩后的干燥長(zhǎng)白落葉松粉末10 g，加入60%乙醇1 000 mL，閃式提取一次，時(shí)間為120 s，過(guò)濾，減壓回收溶劑，用甲醇-水（2：3）定溶于250 mL容量瓶中，使用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，備用。

1.3.1.3 色譜條件

色譜柱：C O S M O S I L 5 C18-M S-Ⅱ（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-1‰甲酸溶液（35：65，V/V）；流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)288 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

1.3.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將1.3.1.1節(jié)制備的對(duì)照品溶液進(jìn)行含量分析。以二氫槲皮素對(duì)照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.1.5 精密度

精密吸取1.3.1.1節(jié)所制備對(duì)照品溶液20 μL，連續(xù)分析5次，測(cè)定峰面積，考察方法的精密度。

1.3.1.6 重復(fù)性

精密稱取過(guò)篩后長(zhǎng)白落葉松干燥粉末5份，每份10 g。按1.3.1.2節(jié)方法制備供試品溶液進(jìn)行分析，測(cè)定峰面積，考察方法的重復(fù)性。

1.3.1.7 穩(wěn)定性

取1.3.1.2節(jié)供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、10 h進(jìn)行分析，測(cè)定峰面積，考察方法的穩(wěn)定性。

1.3.1.8 回收率

精密稱取5 份二氫槲皮素含量為19.08 mg/g的的長(zhǎng)白落葉松樹(shù)材木屑（過(guò)30 目篩）10 g，加入二氫槲皮素對(duì)照品溶液10 mL（質(zhì)量濃度分別為4.4、3.5、2.6 mg/mL），按1.3.1.2節(jié)方法制備供試品溶液后測(cè)定。

1.3.2 二氫槲皮素提取工藝的優(yōu)化

1.3.2.1 單因素試驗(yàn)

將烘干后長(zhǎng)白落葉松粉碎，過(guò)30 目篩，取10 g過(guò)篩后木屑，加入一定量的纖維素酶和蒸餾水，用緩沖液調(diào)pH值至5，55 ℃水浴2 h，100 ℃滅活10 min。加入一定量的乙醇，進(jìn)行閃式提取，提取1 次，過(guò)濾，減壓濃縮，用甲醇-水（2：3）定溶于250 mL容量瓶中，使用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后測(cè)定含量，計(jì)算出二氫槲皮素提取率（每g干燥長(zhǎng)白落葉松木屑所能提取出的二氫槲皮素質(zhì)量/mg）。以二氫槲皮素的提取率為指標(biāo)，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（40%、50%、60%、70%、80%）、閃式提取時(shí)間（60、90、120、150、180 s）、加酶量（1、2、3、4、5 mg/g）和液料比（60：1、80：1、100：1、120：1、140：1）（mL/g）進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.2.2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用響應(yīng)面分析法對(duì)提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。選取對(duì)二氫槲皮素提取率影響較大的3個(gè)因素：乙醇體積分?jǐn)?shù)、加酶量和液料比。通過(guò)Design Expert 8.0軟件，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，對(duì)提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析。分析因素和水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素與水平Table1 Factors and levels used in response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 二氫槲皮素高效液相色譜圖及方法評(píng)價(jià)結(jié)果

由如圖1可知，二氫槲皮素的保留時(shí)間為7.8 min左右。方法的線性回歸方程為Y=21 878 879.12X-1 951 064.44，R2=0.999 7，線性范圍0.044～0.875 mg/mL，計(jì)算得長(zhǎng)白落葉松樹(shù)材木屑中二氫槲皮素平均含量為19.06 mg/g，與已知含量19.08 mg/g接近；本方法的精密度、重復(fù)性良好（RSD分別為1.3%、2.6%）；10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好（RSD為1.9%）；平均加樣回收率（n=9）為99.2%，RSD為2.5%。表明該方法適于二氫槲皮素的測(cè)定。

圖1 二氫槲皮素對(duì)照品（A）和供試品（B）高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of dihydroquercetin standard (A) and sample from pine wood chips (B)

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)二氫槲皮素提取率的影響

固定閃式提取時(shí)間120 s、加酶量3 mg/g、液料比70：1（mL/g），考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)二氫槲皮素提取率的影響。由圖2可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，二氫槲皮素的提取率也隨之增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%時(shí)，二氫槲皮素的提取率達(dá)到最高，這是因?yàn)槎溟纹に仉y溶于水，易溶于乙醇，隨后又隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而降低。因此，Box-Behnken試驗(yàn)選取的乙醇體積分?jǐn)?shù)的范圍為50%～70%。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)二氫槲皮素提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the yield of dihydroquercetin

2.2.2 閃式提取時(shí)間對(duì)二氫槲皮素提取率的影響

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、加酶量3 mg/g、液料比70：1（mL/g），考察閃式提取時(shí)間對(duì)二氫槲皮素提取率的影響。由圖3可知，雖然在150 s時(shí)，提取率有所降低，但所考察提取時(shí)間范圍內(nèi)二氫槲皮素的提取率并沒(méi)有顯著變化，因此在響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)中不再作為考察因素。

圖3 閃式提取時(shí)間對(duì)二氫槲皮素提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction yield of dihydroquercetin

2.2.3 加酶量對(duì)二氫槲皮素提取率的影響

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、閃式提取時(shí)間120 s、液料比70：1（mL/g），考察加酶量對(duì)二氫槲皮素提取率的影響。由圖4可知，隨著加酶量的增加，二氫槲皮素的提取率有所增加，在加酶量為3 mg/g時(shí)達(dá)到最大值，隨后又隨著加酶量的增加而有所降低，纖維素酶的用量應(yīng)和落葉松木屑質(zhì)量形成一定的比例才能發(fā)揮纖維素酶的最佳作用。因此，Box-Behnken試驗(yàn)選取的加酶量的范圍為2～4 mg/g。

圖4 加酶量對(duì)二氫槲皮素提取率的影響Fig.4 Effect of cellulase concentration on the extraction yield of dihydroquercetin

2.2.4 液料比對(duì)二氫槲皮素提取率的影響

圖5 液料比對(duì)二氫槲皮素提取率的影響Fig.5 Effect of liquid-to-material ratio on the extraction yield of dihydroquercetin

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、閃式提取時(shí)間120 s、加酶量3 mg/g，考察液料比對(duì)二氫槲皮素提取率的影響。由圖5可知，隨著液料比的增加，二氫槲皮素的提取率增加，在液料比達(dá)到100：1（mL/g）時(shí)，二氫槲皮素的提取率達(dá)到最大值，隨著液料比繼續(xù)增加，二氫槲皮素的提取率趨于平穩(wěn)，液料比的增加，可使落葉松木屑充分的與溶劑接觸，使有效成分快速溶解到溶劑中。因此Box-Behnken試驗(yàn)選取的液料比的范圍為80：1～120：1（mL/g）。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化工藝條件

試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，試驗(yàn)號(hào)1～12為析因試驗(yàn)，試驗(yàn)號(hào)13～17為中心試驗(yàn)。以二氫槲皮素提取率（Y）為響應(yīng)值，各因素經(jīng)回歸擬合后，得二次多項(xiàng)回歸方程為：

Y=23.22-0.026A＋0.29B＋0.10C＋0.06AB＋0.13AC＋0.067BC-0.14A2-0.32B2-0.41C2

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table2 Design and results of Box-Behnken experiments

表3為回歸模型方差分析結(jié)果，該模型回歸顯著（P＜0.000 1），R2=0.991 7，失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合程度較好，可以用于二氫槲皮素提取的預(yù)測(cè)。從F值的分析結(jié)果（A（F=2.06）、B（F=257.65）、C（F=32.92））可以看出，在所選的各因素水平范圍內(nèi)，對(duì)二氫槲皮素提取率影響大小的順序?yàn)椋杭用噶浚疽毫媳龋疽掖俭w積分?jǐn)?shù)。

從圖6可以看出，圖中均存在極值，即響應(yīng)面的最高點(diǎn)，說(shuō)明試驗(yàn)所選范圍較合理。從圖6A可以看出，加酶量對(duì)二氫槲皮素提取率的影響較大，而乙醇體積分?jǐn)?shù)相對(duì)較為平緩，說(shuō)明乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響較小，兩者交互作用較弱。由圖6B可知，液料比的響應(yīng)面變化更明顯、變化范圍更大；相反，乙醇體積分?jǐn)?shù)變化較為平緩，從液料比的等高線與坐標(biāo)軸的交點(diǎn)較多也可以看出液料比對(duì)二氫槲皮素的影響較大，等高線為橢圓形，極值對(duì)應(yīng)的點(diǎn)接近橢圓形的中心，說(shuō)明兩因素有很強(qiáng)的交互作用。從圖6C可以看出，加酶量相對(duì)于液料比對(duì)提取率的影響更大，并且兩者有一定的交互作用，但等高線幾乎為圓形，說(shuō)明作用不是很強(qiáng)。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table3 Analysis of variance for the fitted regression model

圖6 各因素交互作用的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plots for the effects of three process conditions on the extraction yield of dihydroquercetin

2.4 提取工藝條件的確定

結(jié)合回歸模型分析結(jié)果可知，酶輔助閃式提取二氫槲皮素的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)60.93%、加酶量3.48 mg/g、液料比103.64：1（mL/g）、提取時(shí)間120 s?？紤]到實(shí)際操作的可行性，將最優(yōu)提取工藝調(diào)整為乙醇體積分?jǐn)?shù)61%、加酶量3.5 mg/g、液料比104：1（mL/g）、提取時(shí)間120 s，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，在此條件下二氫槲皮素的理論提取率為23.30 mg/g，實(shí)際提取率為23.22 mg/g。因此，響應(yīng)面分析法所優(yōu)化的最佳提取工藝數(shù)據(jù)真實(shí)可靠，可應(yīng)用到酶輔助閃式提取二氫槲皮素的實(shí)際生產(chǎn)中。

3 結(jié) 論

應(yīng)用響應(yīng)面分析法對(duì)酶輔助閃式提取二氫槲皮素的提取工藝進(jìn)行研究，采用合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)提取工藝進(jìn)行全面的剖析和評(píng)測(cè)，從而得到二氫槲皮素的最佳提取工藝：乙醇體積分?jǐn)?shù)60.93%、加酶量3.48 mg/g、液料比103.64：1（mL/g）、提取時(shí)間120 s。應(yīng)用此條件，二氫槲皮素的理論提取率為23.30 mg/g，實(shí)際提取率為23.22 mg/g。實(shí)際值與理論值基本相符，證明試驗(yàn)?zāi)Ｐ涂煽俊⒗w維素酶應(yīng)用到二氫槲皮素的提取，可以大幅度的提高提取率，閃式提取方法簡(jiǎn)便、節(jié)能、省時(shí)，可應(yīng)用于二氫槲皮素的提取和生產(chǎn)。

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Optimization of Cellulase-Assisted Extraction of Dihydroquercetin by Response Surface Methodology

CHAI Jing, FU Jing-hui, ZHANG Wei-peng, ZHENG Yi-nan, LIU Wen-cong*
(College of Traditional Chinese Medicine, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Objective: To optimize the celluase-assisted extraction of dihydroquercetin from Larix olgensis Henry var. koreana Nakai wood chips by response surface methodology (RSM). Methods: Dihydroquercetin was extracted with ethanol in a herbal blitzkrieg extractor from pine wood chips pre-hydrolyzed with celluase. On the basis of the results of single-factor experiments, a Box-Behnken design was performed to optimize three extraction conditio ns including ethanol concentration, enzyme dosage and liquid-to-solid ratio. Results: The optimal extraction conditions were determined as hydrolysis with an enzyme dosage of 3.48 mg/g and subsequent extraction for 120 s with 60.93% ethanol in water at a liquid-to-solid ratio of 103.64:1 (mL/g). Conclusion: The proposed extraction procedure can provide a simple, energy-saving and time-saving way for massive production of dihydroquercetin.

Larix olgensis Henry var. koreana Nakai; dihydroquercetin; cellulase; extraction; response surface methodology (RSM)

R931.6

A

1002-6630（2014）10-0093-05

10.7506/spkx1002-6630-201410017

2013-07-30

吉林省科技廳項(xiàng)目（20115064）

柴婧（1988 —），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail：chaijing880426@qq.com

*通信作者：劉文叢（1968—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail：jwlw6803@126.com