維生素C對(duì)酮康唑抑制白色念珠菌的影響研究

張祥濤 于立權(quán)

維生素C對(duì)酮康唑抑制白色念珠菌的影響研究

張祥濤 于立權(quán)*

（山東聯(lián)創(chuàng)建筑(礦業(yè))設(shè)計(jì)有限公司 山東 濟(jì)南 250000） （黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 黑龍江 大慶）

為研究酮康唑治療畜禽真菌感染過(guò)程中能否給與維生素C輔助治療，體外測(cè)試了添加維生素C后白念珠菌對(duì)酮康唑的敏感性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，維生素C能顯著抑制酮康唑?qū)Π咨钪榫拿舾行裕瑸榭茖W(xué)治療畜禽機(jī)會(huì)性真菌臨床感染提供了依據(jù)。

維生素C 酮康唑 白色念珠菌

白色念珠菌(Candida albicans)是臨床重要的條件致病性真菌[1]，在獸醫(yī)臨床廣泛存在。由于抗生素、皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等藥物的廣泛使用和濫用，以及用藥消毒不嚴(yán)格、飼舍衛(wèi)生差、畜禽營(yíng)養(yǎng)不良等因素，像頑固性奶牛乳房炎[2]、奶牛子宮內(nèi)膜炎[3]和禽消化道真菌病[4]等畜禽條件性念珠菌病越來(lái)越多，往往會(huì)造成誤診或漏診，給獸醫(yī)臨床診治帶來(lái)嚴(yán)重困擾。

酮康唑?qū)龠量╊?lèi)抗真菌藥，對(duì)深部感染真菌如念珠菌屬等具有抗菌作用，是臨床常用的抗真菌藥[5]。L-抗壞血酸(VC)是一種水溶性維生素，可以保護(hù)如谷胱甘肽等抗氧化劑，發(fā)揮抗氧化作用[6]。為此，本文對(duì)抗壞血酸對(duì)酮康唑抑制白念珠菌的影響進(jìn)行了研究，以期指導(dǎo)白念珠菌病的臨床治療，為畜禽白念珠菌病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株和培養(yǎng)基 白色念珠菌RM1000，由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命院4056實(shí)驗(yàn)室提供；YPD培養(yǎng)基用胰蛋白胨和酵母提取物為OXOID公司產(chǎn)品，營(yíng)養(yǎng)瓊脂為北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司產(chǎn)品。Vc為天津市博迪化工有限公司產(chǎn)品；谷胱甘肽(L-GSH，還原型)為山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司產(chǎn)品；酮康唑(KCZ)為成都貝斯特試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 培養(yǎng)基及試劑配制 液體YPD培養(yǎng)基(2%胰蛋白胨；1%酵母提取物；2%葡萄糖)，固體YPD培養(yǎng)基添加2%的瓊脂粉，121℃滅菌20min備用。分別配制0.5M的Vc、0.5M的GSH和10μg/ml的KCZ貯存液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 菌株生長(zhǎng)期測(cè)試 取白色念珠菌RM1000，無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)劃線(xiàn)法YPD平板接種活化，標(biāo)記后30℃恒溫培養(yǎng)。挑新鮮單菌落接種于2-3ml YPD液體培養(yǎng)基中180rpm過(guò)夜培養(yǎng)后，按1:100(v/v)比例轉(zhuǎn)接新鮮的YPD液體培養(yǎng)基，間隔2h取樣，測(cè)OD600，共記錄至58h。

1.4 添加Vc后菌株對(duì)KCZ的敏感性測(cè)試

按照上述方法，按照1:100(v/v)的比例接種菌液于新鮮的YPD液體培養(yǎng)基后，加入終濃度5mM的Vc和100ng/ml的KCZ(KCZ+Vc組)，分別在作用0、0.5、1、6、12、24、36和48h后，取1ml菌液，5000rpm離心后，1ml滅菌ddH2O重懸，取100ml重懸液加入到900ulddH2O中，充分漩渦后，取100ml懸浮液涂布于YPD平板，30℃培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。同時(shí)，設(shè)置KCZ+Vc+GSH、Vc+GSH、Vc、GSH、KCZ和ddH2O 6個(gè)對(duì)照組。

2 結(jié)果

2.1 菌株RM1000不同生長(zhǎng)期的確定 首先測(cè)試了白念珠菌RM1000菌株的生長(zhǎng)期。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白念珠菌菌株RM1000在30h達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，OD值達(dá)到最大值(圖1)，為后續(xù)進(jìn)行酮康唑敏感性測(cè)試實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

圖1 白色念珠菌菌株RM1000的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

2.2 體外添加Vc影響白念菌RM1000對(duì)KCZ的敏感性 參照公開(kāi)發(fā)表的文獻(xiàn)[7]，選用添加5mM Vc進(jìn)行測(cè)試不完全殺死劑量(100ng/ml)的KCZ對(duì)白念珠菌RM1000的敏感性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加維生素C后，能夠顯著降低白念珠菌對(duì)酮康唑的敏感性。單獨(dú)添加維生素C或還原型谷胱甘肽后，白念珠菌細(xì)胞增殖活力明顯增強(qiáng)(圖2)。

圖2 維生素C對(duì)KCZ抑制白念珠菌RM1000的影響

3 討論

唑類(lèi)藥物具有抗真菌譜廣、副作用小和口服吸收好等優(yōu)點(diǎn)，在臨床上應(yīng)用廣泛。酮康唑通過(guò)干擾細(xì)胞色素P-450的活性，從而抑制真菌細(xì)胞膜主要固醇類(lèi)-麥角固醇的生物合成，損傷真菌細(xì)胞膜并改變其通透性，以致重要的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外漏，還可以抑制真菌的三酰甘油和磷脂的生物合成，抑制氧化酶和過(guò)氧化酶的活性，引起細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫積聚導(dǎo)致細(xì)胞亞微結(jié)構(gòu)變性和細(xì)胞壞死。谷胱甘肽是由谷氨酸、胱氨酸和甘氨酸組成的短肽，在體內(nèi)有氧化還原作用。它有兩種存在形式，即氧化型和還原型，還原型對(duì)保證細(xì)胞膜的完整性起重要作用。VC是一種強(qiáng)抗氧化劑，其本身被氧化，而使氧化型谷胱甘肽還原為還原型谷胱甘肽，從而發(fā)揮抗氧化作用[8]。為研究在畜禽感染白念珠菌疾病應(yīng)用酮康唑治療的過(guò)程中，是否可以飼料添加或口服給與維生素C輔助治療來(lái)提高畜禽機(jī)體免疫力，通過(guò)體外添加維生素C的方法來(lái)測(cè)試白念珠菌菌株對(duì)酮康唑的敏感性，結(jié)果與前人的報(bào)道一致[7]，說(shuō)明維生素C可能通過(guò)干擾過(guò)氧化氫的累積而影響著白念珠菌對(duì)酮康唑的敏感性，具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果為科學(xué)治療畜禽機(jī)會(huì)性真菌臨床感染提供了依據(jù)。

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（2014–02–20）

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