五大連池地區(qū)香鱗毛蕨自然越冬特性研究

常纓，李艷，安玉婷，張志美，王鶴萌，張微

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

五大連池地區(qū)香鱗毛蕨自然越冬特性研究

常纓，李艷，安玉婷，張志美，王鶴萌，張微

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

探討黑龍江省五大連池地區(qū)香鱗毛蕨越冬機制，對其自然越冬過程中的生理生化特性及超微結(jié)構(gòu)進行研究。結(jié)果表明，香鱗毛蕨相對電導(dǎo)率和MDA含量先增加后減少；POD、CAT兩種保護酶活性呈“N”型，SOD活性先降低后升高；脯氨酸和可溶性糖含量均呈“N”型變化，可溶性蛋白含量變化不明顯；ABA含量隨溫度下降而上升，GA3、IAA含量與ABA趨勢相反；葉片中的葉綠體，體積膨脹變形，基粒片層逐漸不清晰，但未全部解體；線粒體內(nèi)脊數(shù)量明顯減少，雙層膜結(jié)構(gòu)破壞嚴重，膜邊界模糊，直至膜遭到嚴重破壞，解體消失。

香鱗毛蕨；自然越冬；生理機理；保護酶；抗寒性

香鱗毛蕨（Dryopteris fragrans（L.）Schott）是多年生蕨類植物，以黑龍江省為分布中心，在塔河縣白卡魯山、呼中的大白山高地、牡丹江鏡泊湖及小興安嶺北部高寒地區(qū)均有分布，特別是在五大連池地區(qū)分布廣泛[1]。香鱗毛蕨生境特殊，生長于火山噴發(fā)后形成的滑石坡、火山周圍巖漿縫中，在低溫環(huán)境可生存[2]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)香鱗毛蕨對皮膚病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、抑菌等具有很好療效[3-5]，是極具開發(fā)潛力和應(yīng)用前景的珍稀天然藥用植物資源，但其藥材來源靠野生采挖，由于人類盲目采收以及對熔巖環(huán)境的破壞致使香鱗毛蕨資源不斷減少，野生資源正遭到嚴重破壞。

植物在自然越冬過程中對低溫逆境有一個適應(yīng)和自我調(diào)節(jié)過程，低溫促使植物細胞發(fā)生一系列生理生化變化[6-8]。低溫嚴重影響香鱗毛蕨的正常生長發(fā)育，野生香鱗毛蕨主要依靠根狀莖進行繁殖并且能自然越冬，獨特的生理特性增加了香磷毛蕨對低溫的適應(yīng)能力。

本試驗探究五大連池地區(qū)野生香鱗毛蕨自然越冬期間的低溫生理學(xué)適應(yīng)機制，探討低溫對香鱗毛蕨生長發(fā)育過程生理生化反應(yīng)的影響，對香鱗毛蕨低溫脅迫下的葉片進行超微結(jié)構(gòu)體觀察，為進一步了解香鱗毛蕨生長機制、指導(dǎo)生產(chǎn)實踐提供可靠的理論依據(jù)，對香鱗毛蕨野生資源低溫保護和可持續(xù)利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗樣地越冬期間的氣溫變化

五大連池市位于黑龍江省北部，黑河市南部，地處小興安嶺與松嫩平原的過渡地帶。東起東經(jīng)127°37′，西至125°42′；南起北緯48°16′，北至49°12′。五大連池氣候特征是冬長夏短，低溫冷濕，年平均氣溫0℃左右，年平均降水量500 mm左右。平均海拔高度為250～300 m，屬寒溫帶大陸性季風(fēng)氣候，夏季較炎熱，最高日溫可達34℃，多見于6～8月；冬季較冷，氣溫一般在-20℃左右，最低日溫可達-36℃，無霜期121 d。

根據(jù)采集樣品實際測量結(jié)果表示，2011～2012年越冬期，五大連池二池地區(qū)最高氣溫出現(xiàn)在2011年10月中旬，為5.8℃，隨后氣溫大幅度下降，到翌年1月左右氣溫達到最低值，為-28℃，2012年2月、2012年3月氣溫基本與2011年11月、2011年12月氣溫保持一致，2012年3月氣溫回升到0℃，越冬期的6個月平均氣溫為-7.6℃。各采樣日氣溫變化如圖1所示。

圖1 各采樣日期的氣溫變化Fig.1 Temperature records at each sampling date

1.1.2 材料來源

野生香鱗毛蕨孢子體植株于2011年10月至2012年3月每個月中旬赴黑龍江省五大連池二池火山巖地區(qū)采集，采集時間及外部形態(tài)如表1所示；每次選取長勢相同的整株香鱗毛蕨植株10株，混合后分裝并標記，迅速放入液氮中冷凍，-80℃保存?zhèn)溆?。每個樣品3次重復(fù)。

表1 香鱗毛蕨越冬期間外部形態(tài)變化Table 1 Changes of Dryopteris fragrans external morphology during the winter

1.2 方法

1.2.1 測定指標及方法

相對電導(dǎo)率（Electrical conductivity）采用電導(dǎo)儀法測定[9]；丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量采用硫代巴比妥酸比色法測定[10]；超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）采用氮藍四唑比色法測定[10]；過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性采用愈創(chuàng)木酚比色法測定[10]；過氧化氫酶（Catalase，CAT）采用碘量法測定[11]；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250比色法測定[11]；可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定[12]；脯氨酸含量采用磺基水揚酸提取茚三酮比色法測定[12]；參照植物生理學(xué)實驗技術(shù)高效液相色譜法[13]測定脫落酸（Abscisic Acid，ABA）、吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）、赤霉素（Gibberellin，GA3）含量，用美國Waters 600型高效液相色譜儀測定，測定條件流動相為100%甲醇-水-冰乙酸(體積比為45：54.2：0.8)混合液，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為室溫，進樣量為20 μL，檢測波長為254 nm，定量方法為外標標準曲線法。每個樣品3次取樣，3次測量重復(fù)。

1.2.2 葉片超微結(jié)構(gòu)觀察方法

采用透射電鏡方法[14]對香鱗毛蕨葉片超微結(jié)構(gòu)進行觀察，對越冬期間香鱗毛蕨葉片葉肉部位進行取樣，并用戊二醛進行前固定，經(jīng)過清洗、后固定、清洗、脫水、浸透、包埋、修塊、切片、染色等過程，最后在透射電鏡下對香鱗毛蕨葉片葉綠體和線粒體進行觀察并拍照。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析及圖像處理軟件

數(shù)據(jù)均用Microsoft Excel 2003進行計算并制圖，SPSS11.5對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析進行差異顯著性分析，并對各指標進行相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 越冬期間香鱗毛蕨質(zhì)膜相對透性和膜脂過氧化的動態(tài)變化

2.1.1 質(zhì)膜相對透性的動態(tài)變化

在低溫下植物的膜結(jié)構(gòu)受到破壞，破壞程度隨溫度的降低而增加，膜的破壞程度可以通過細胞內(nèi)電解質(zhì)外滲率，即相對電導(dǎo)率大小判斷。香鱗毛蕨在自然越冬期間相對電導(dǎo)率的總體動態(tài)變化趨勢表現(xiàn)為先升后降。如表2所示，從2011年10月五大連池地區(qū)氣溫開始持續(xù)下降，冬長夏短的氣候特征導(dǎo)致深冬季節(jié)環(huán)境溫度變化不大，隨著自然降溫過程中溫度的降低和低溫持續(xù)時間的延長表現(xiàn)為電導(dǎo)率不斷升高，在2011年12月到2012年2月，香鱗毛蕨電導(dǎo)率處于較平穩(wěn)趨勢，分別為0.33、0.35、0.34，在2012年1月測量值達到最大，2月到3月期間，隨溫度的回升，電導(dǎo)率降至0.23。

表2 自然越冬過程中香鱗毛蕨各項生理指標的動態(tài)變化Table 2 Dynamic change of various physiological indices of Dryopteris fragrans during the winter

2.1.2 膜脂過氧化的動態(tài)變化

植物在逆境脅迫過程中，膜脂過氧化的中間產(chǎn)物自由基和最終產(chǎn)物MDA都會嚴重損傷生物膜。所以，MDA是膜系統(tǒng)受害的標志之一，也用于評價植物對低溫條件反應(yīng)的強弱。如表2所示，在自然越冬過程中隨著自然溫度的下降，2011年10月到2012年1月MDA活性升高，低溫脅迫加劇膜脂過氧化強度，導(dǎo)致MDA含量由7.63 μg·g-1緩慢增加至11.9 μg·g-1，增加幅度為55.9%；2012年2月至2012年3月，隨著溫度的持續(xù)回升和低溫脅迫逐漸解除，MDA含量也因此從11.25 μg·g-1緩慢下降至10.00 μg·g-1，下降幅度為12.5%。

2.2 越冬期間香鱗毛蕨保護酶活性的動態(tài)變化

2.2.1 超氧化物歧化酶（SOD）活性的變化

SOD是活性氧清除劑中的核心成員，在低溫逆境條件下，SOD能被活性氧誘導(dǎo)產(chǎn)生，從而減輕細胞膜的受害程度。在自然越冬過程中，香鱗毛蕨中SOD活性隨著環(huán)境溫度的變化，總體上呈現(xiàn)小幅度的先降后升變化趨勢，結(jié)果如表2所示。在低溫脅迫下，調(diào)節(jié)適應(yīng)機制的局限性，超過一定限度，從2011年10月開始，SOD酶活性開始隨溫度的降低逐漸變?nèi)酰?012年1月達到最低值90 U·g-1。2012年2月溫度回升后，香鱗毛蕨植株進入生長階段，SOD活性逐漸升高，促進香鱗毛蕨生長，3月達到最高值210 U·g-1。

2.2.2 過氧化物酶（POD）活性的變化

在自然越冬中，如表2所示，香鱗毛蕨中POD酶活性隨時間的變化總體呈類似“N”型變化趨勢。2011年11月POD酶活性升高到31.19 U·g-1·min-1，表明隨著溫度的降低，香鱗毛蕨細胞中H2O2大量積累，從而香鱗毛蕨細胞中POD酶活性逐漸增強，清除過剩的H2O2，保護香鱗毛蕨組織細胞免受傷害。在2011年12月至2012年2月，POD酶活性一直處于較低水平，最低值出現(xiàn)在2月，為18.67 U·g-1·min-1。隨著溫度回升，POD活性開始變強，2012年3月值為25 U·g-1·min-1。

2.2.3 過氧化氫酶（CAT）活性的變化

在整個自然越冬采樣期，如表2所示，CAT酶活性同樣呈先升后降再上升的變化趨勢。2011年11月CAT酶活性從84.15 U·g-1·min-1增加至97 U· g-1·min-1，表明隨著溫度的降低，香鱗毛蕨細胞中H2O2大量積累，植物為減輕和防止H2O2對細胞的傷害，CAT活性逐漸增強，清除過剩的H2O2，保護香鱗毛蕨組織細胞免受傷害。隨后CAT活性開始下降，到2012年2月，一直維持較低活性，2012年2月以后，隨氣溫回升，CAT活性開始變強，2012年3月達到最高值125.66 U·g-1·min-1。

2.3 越冬期間香鱗毛蕨滲透調(diào)節(jié)物含量的動態(tài)變化

2.3.1 可溶性蛋白含量的變化

隨著溫度降低，如表2所示，香鱗毛蕨中可溶性蛋白含量呈現(xiàn)上升趨勢，2011年11月含量達到1.89 μg·g-1。但隨著越冬時間的持續(xù)，可溶性蛋白含量小幅度降低，說明香鱗毛蕨在抵御外界環(huán)境的變化時，導(dǎo)致部分蛋白質(zhì)發(fā)生降解，2011年12月以后，可溶性蛋白雖然仍在減少，但變化幅度相對較小，整體趨勢趨于平緩。

2.3.2 可溶性糖含量的變化

在自然越冬過程中，如表2所示，香鱗毛蕨內(nèi)可溶性糖含量隨自然溫度的變化總體表現(xiàn)出“N”型變化趨勢。2011年10～11月，香鱗毛蕨能夠在低溫誘導(dǎo)下通過增加組織中可溶性糖的含量增強細胞保水能力以獲得低溫適應(yīng)性，可溶性糖含量為72.03～74.91 μg·g-1，含量升高7%。隨著寒冬的到來，可溶性糖含量維持在較低水平，隨后3個月里，可溶性糖含量緩慢降低，最低值出現(xiàn)在2012年2月，為24.5 μg·g-1。之后隨著溫度回升，可溶性糖含量提高到49.56 μg·g-1，為提高香鱗毛蕨細胞的吸水能力，適應(yīng)初春溫度變化提供生理條件。

2.3.3 脯氨酸含量的變化

在自然越冬過程中，如表2所示，香鱗毛蕨中脯氨酸含量呈現(xiàn)先降后升再下降的“N”型變化趨勢。2011年12月到2012年2月脯氨酸含量一直保持在較低水平，最低值達到25 μg·g-1，之后隨著溫度的升高升高到46.66 μg·g-1，有助于香鱗毛蕨在較低溫度下生長，說明香鱗毛蕨在受到低溫脅迫后，迅速調(diào)節(jié)體內(nèi)滲透能力以適應(yīng)環(huán)境變化，從而減少低溫對細胞的傷害。但隨著脅迫時間的持續(xù)，脯氨酸含量達到峰值后又有所下降，這可能是由于低溫脅迫條件下碳水化合物供應(yīng)受阻，影響谷氨酸形成，進而影響脯氨酸合成。

2.4 越冬期間香鱗毛蕨葉片內(nèi)源激素含量的動態(tài)變化

2.4.1 越冬過程中香鱗毛蕨ABA含量的變化

如表2所示，在越冬過程中，香鱗毛蕨中ABA含量經(jīng)歷先升后降的變化趨勢。隨著越冬過程中氣溫的降低，香鱗毛蕨中ABA含量在2011年11月達到最大值23.693 μg·g-1。隨后ABA含量逐漸下降，到2012年3月，ABA含量為6.78 μg·g-1，同2011年11月相比，下降71.38%。

2.4.2 越冬過程中香鱗毛蕨IAA含量的變化

如表2所示，香鱗毛蕨中IAA含量呈現(xiàn)先降后升的趨勢。隨著溫度的降低，IAA含量從2011年10月的16.62 μg·g-1下降到2012年1月的1 μg·g-1。然后隨著溫度回升，IAA含量開始上升，最大值為13.18 μg·g-1。

2.4.3 越冬過程中香鱗毛蕨中赤霉素（GA3）含量的變化

如表2所示，香鱗毛蕨中GA3含量整體上呈現(xiàn)先降后升變化趨勢。隨著溫度的降低，GA3含量從2011年10月的157.21 μg·g-1下降到2012年1月的24.43 μg·g-1。然后隨著溫度的回升，GA3含量的最大值達到455.12 μg·g-1。

2.5 香鱗毛蕨越冬期間各生理指標相關(guān)性分析

如表3所示，在自然越冬過程中，香鱗毛蕨電導(dǎo)率與MDA含量、可溶性糖含量、SOD活性呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，與可溶性蛋白、脯氨酸、POD、CAT、IAA、GA3呈負相關(guān)；MDA含量與可溶性蛋白含量呈極顯著正相關(guān)，與SOD活性顯著相關(guān)，與脯氨酸含量、POD及CAT活性呈負相關(guān)，與IAA活性呈極顯著負相關(guān)，與GA3呈顯著負相關(guān)；可溶性蛋白含量與可溶性糖含量、POD活性及IAA、GA3呈負相關(guān)，與SOD活性呈顯著正相關(guān)，與ABA顯著相關(guān)；可溶性糖與脯氨酸含量、POD及CAT活性、IAA及GA3含量呈負相關(guān)；脯氨酸含量與SOD活性、ABA含量呈正相關(guān)，與CAT活性呈顯著正相關(guān)；SOD活性與POD活性呈顯著正相關(guān)，與ABA含量正相關(guān)；POD與CAT活性與ABA含量正相關(guān)；ABA與IAA及GA3呈負相關(guān)，而IAA和GA3呈顯著正相關(guān)。

表3 各項生理指標相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of various physiological indices

2.6 越冬期間香鱗毛蕨葉片超微結(jié)構(gòu)變化

2.6.1 葉綠體超微結(jié)構(gòu)的變化

葉片最重要的功能是進行光合作用，而葉綠體正是光合作用發(fā)生的場所。由于香鱗毛蕨葉片從12月至翌年3月初均處于萎蔫狀態(tài)，所以本試驗對2011年10～12月的香鱗毛蕨葉片進行超微結(jié)構(gòu)觀察。通過對香鱗毛蕨葉片葉肉細胞的超微結(jié)構(gòu)觀察，葉肉細胞內(nèi)的葉綠體皆緊貼細胞壁分布，一般呈紡錘形，環(huán)繞在葉肉細胞四周，葉綠體中含有數(shù)量和大小不等的淀粉粒和嗜鋨顆粒。

2011年10月的香鱗毛蕨葉片中葉綠體為橢圓形或近圓形，被膜清晰，類囊體多，類囊體基粒和片層排列整齊，片層間隙有大小不一的淀粉粒和嗜鋨顆粒，整個葉綠體結(jié)構(gòu)清晰，見圖版I-a、b。隨著溫度的降低，葉綠體位置并未發(fā)生變化，仍整齊地單行排列在細胞壁周圍，但葉綠體內(nèi)淀粉粒聚集變少并且變小，基粒片層排列基本整齊，只有少部分有斷裂。到11月時，葉綠體超微結(jié)構(gòu)遭到嚴重破壞，基粒片層不清晰，體積膨脹變形，排列位置發(fā)生變化，出現(xiàn)在細胞中央，見圖版I-d,e，但是并未解體，見圖版I-g，此即香鱗毛蕨葉片在隨后的12月到翌年3月仍有部分呈綠色的原因。

嗜鋨顆粒隨著溫度的降低先聚集增多后逐漸減少，見圖版I-a、d。嗜鋨顆粒是鋨酸與酚類作用形成的物質(zhì)，故嗜鋨顆粒的積累說明細胞中有大量酚類物質(zhì)存在，植物多酚是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的次生代謝物質(zhì)，具有較強的氧化活性，可清除植物在逆境條件下細胞中產(chǎn)生的自由基。

2.6.2 線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化

植物可通過激活細胞內(nèi)ATP酶的水解活性，增強能量釋放抵御寒冷。線粒體在能量轉(zhuǎn)換中起著其他細胞結(jié)構(gòu)無法取代的作用，它與植物低溫適應(yīng)性有密切關(guān)系。

線粒體發(fā)育正常時呈圓球形，位于葉綠體之間或葉綠體與質(zhì)膜的連接處，數(shù)量不多，具有完整的膜結(jié)構(gòu)，嵴的數(shù)量較多，見圖版I-c。在越冬期間，隨溫度的降低，香鱗毛蕨葉片中的線粒體部分形狀發(fā)生變化，呈橢圓形，內(nèi)脊數(shù)量明顯減少，但膜結(jié)構(gòu)完整。2011年11月時線粒體已經(jīng)沒有明顯的內(nèi)脊，雙層膜破壞嚴重，膜邊界模糊，見圖版I-f。在2011年11～12月份，線粒體嚴重膨脹，其線粒體膜遭到破壞，最后解體消失見圖版Ⅰ-g）。

圖版Ⅰ 自然越冬期間香鱗毛蕨葉片超微結(jié)構(gòu)變化PlateⅠ Change of leaf ultrastructure of Dryopteris fragrans during the winter

3 討論

3.1 自然越冬對香鱗毛蕨質(zhì)膜相對透性和膜脂過氧化的影響

生物膜系統(tǒng)與植物耐低溫性關(guān)系密切，電解質(zhì)滲透率可以作為一種反映植物細胞膜受低溫傷害程度的指標；膜脂過氧化產(chǎn)物MDA是另一種反映細胞膜受傷害程度的指標，嚴重損傷細胞膜，這種損傷主要是因為MDA與膜中蛋白質(zhì)結(jié)合而引起蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)，引發(fā)膜脂過氧化程度加劇，細胞膜透性增大，膜傷害程度增大[15]。香鱗毛蕨在越冬期間相對電導(dǎo)率與MDA含量均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，與溫度呈負相關(guān)關(guān)系。本試驗結(jié)果與沈靜研究結(jié)果[16]一致。

3.2 自然越冬對香鱗毛蕨保護酶活性的影響

低溫下植物活性氧代謝的強弱與植物低溫適應(yīng)性關(guān)系密切。低溫脅迫時，植物體內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧自由基，導(dǎo)致膜質(zhì)過氧化程度增加，造成膜系統(tǒng)的傷害，及時清除體內(nèi)的活性氧有利于植物抗低溫脅迫，相關(guān)作用的酶類主要有SOD、POD和CAT。本試驗結(jié)果表明，酶活性的提高和降低與植物耐低溫性的強弱呈一定相關(guān)性。自然越冬期間香鱗毛蕨SOD活性隨著溫度的變化而變化，呈正相關(guān)，與戴金平等對黃瓜、已經(jīng)改良過的番茄幼苗、耐寒性強的葡萄、白三葉的SOD活性的報道相符合，SOD活性與低溫呈正相關(guān)關(guān)系[17-20]。但是香鱗毛蕨中的POD和CAT活性變化曲線均呈“N”型，可能是因為香鱗毛蕨植物組織耐低溫力的大小與自身維持活性氧代謝平衡的能力有關(guān)。但隨著溫度的繼續(xù)降低，各種酶活性開始逐漸下降，植物體內(nèi)的氧代謝失調(diào)，細胞內(nèi)自由基產(chǎn)生和消除的平衡受到破壞而出現(xiàn)自由基積累，并引發(fā)或加劇細胞膜過氧化，MDA含量增多，導(dǎo)致香鱗毛蕨酶活性表現(xiàn)出表達量低的現(xiàn)象，從2011年12月到2012年2月一直維持在較低水平。

3.3 自然越冬對香鱗毛蕨滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

在植物抗低溫脅迫過程中，體內(nèi)會大量積累各種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，賦予植物多種滲透調(diào)節(jié)的能力。崔紅等研究表明，香鱗毛蕨在低溫條件下，通過抗氧化酶和內(nèi)源激素的調(diào)節(jié)，細胞內(nèi)主動積累可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)和游離脯氨酸，使細胞滲透勢下降，提高細胞液濃度，增加束縛水含量，降低冰點，可緩和細胞質(zhì)過度脫水，保持細胞不致遇冷凝固，提高香鱗毛蕨低溫適應(yīng)性。本試驗結(jié)果與崔紅等研究結(jié)果[21]一致，但同種植物不同生長階段對低溫的適應(yīng)性有很大差異。香鱗毛蕨野生植株中蛋白質(zhì)含量變化不明顯，其他兩種物質(zhì)含量在越冬期間呈“N”型變化，并不隨環(huán)境溫度降低而持續(xù)升高，隨著溫度的繼續(xù)降低，酶活性逐漸下降，由此引起香鱗毛蕨滲透調(diào)節(jié)物的代謝失衡，出現(xiàn)下降趨勢，從2011年12月到2012年2月一直維持在較低水平。

3.4 自然越冬對香鱗毛蕨葉片內(nèi)源激素含量的影響

植物內(nèi)源激素被大多數(shù)研究者認為是植物對抗寒基因表達的啟動因子，特別是脫落酸ABA對植物抗寒力的調(diào)控以及對維持細胞膜結(jié)構(gòu)功能起重要作用[22]。IAA和GA3為促生長類激素，對植物生長發(fā)育主要起促進作用，逆境條件下植物一般需要降低生長速度以度過不良環(huán)境。楊廣東等研究結(jié)果表明，低溫適應(yīng)性強的植物品種比低溫適應(yīng)性弱的植物品種GA3含量低；溫度越低，抗性較強的辣椒品種ABA含量越高[23]。本研究中，香鱗毛蕨在自然越冬低溫脅迫時ABA含量升高，而GA3和IAA含量隨著溫度的降低而降低。研究結(jié)果說明低溫環(huán)境下香鱗毛蕨能夠通過調(diào)節(jié)自身的內(nèi)源激素減輕低溫傷害，維持植物體正常生長及生理代謝功能，表現(xiàn)出一定的耐低溫性。植物生理過程很大程度上受激素的促進作用和抑制作用的平衡調(diào)節(jié)，如ABA與GA3有共同的合成前體，二者的許多生理作用相互拮抗，已知植物的生長與休眠主要由ABA和GA3調(diào)節(jié)。沈漫利用露地栽培的常春藤為材料進行研究，結(jié)果表明露地栽培的常春藤具有較強的低溫適應(yīng)性，其ABA含量顯著高于溫室栽培的常春藤，GA3含量低于溫室栽培的常春藤，ABA/GA3比值與溫度呈負相關(guān)[24]；黃濤等研究發(fā)現(xiàn)在低溫適應(yīng)性中ABA/GA3的作用比ABA或GA3的絕對含量更重要，抗性強的水稻品種ABA/GA3比抗性弱的品種變化幅度大[25]。本文結(jié)果同時表明，隨溫度的降低，野生香鱗毛蕨葉片中ABA/GA3比總體變化為先升高后降低，并且溫度越低，變化幅度越大，與曲凌慧等研究結(jié)果[26]相似。以上結(jié)果表明，內(nèi)源激素ABA、IAA、GA3及ABA/GA3比與香鱗毛蕨低溫適應(yīng)性呈正相關(guān)，初步認為其可作為香鱗毛蕨低溫適應(yīng)性的鑒定指標。

3.5 自然越冬對香鱗毛蕨葉片超微結(jié)構(gòu)的影響

香鱗毛蕨葉片中橢球形或圓形的葉綠體結(jié)構(gòu)清晰，隨著入冬季節(jié)溫度的持續(xù)降低，細胞壁周圍的葉綠體超微結(jié)構(gòu)遭到嚴重破壞，淀粉粒聚集變少并且變小，光合作用產(chǎn)物減少，基粒片層組織逐漸模糊，組織結(jié)構(gòu)遭到破壞，隨著基粒片層位置的移動，細胞內(nèi)其他物質(zhì)的變化，葉綠體并沒有解體消失。線粒體在植物的生長過程中不斷的提供能量，隨著溫度的降低，線粒體的位置和形狀發(fā)生變化，重要的結(jié)構(gòu)嵴由數(shù)量變少，最后被嚴重破壞，解體消失。本試驗結(jié)果與趙明明對幾種冬青屬植物抗寒性進行比較研究的結(jié)果[27]一致，認為隨著脅迫溫度的降低，細胞內(nèi)細胞器逐漸損傷，嗜鋨顆粒增多，葉綠體也逐漸變形扭曲，且位置發(fā)生變化，細胞器結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性同植株的抗低溫能力呈正相關(guān)，即冷害引起的各類細胞器結(jié)構(gòu)的變化及其破壞程度，取決于植物的耐低溫性[27-28]。

4 結(jié)論

香鱗毛蕨在越冬期間相對電導(dǎo)率與MDA含量均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，與溫度呈負相關(guān)關(guān)系。自然越冬期間香鱗毛蕨保護酶SOD活性隨著溫度的變化而變化，呈正相關(guān)，POD和CAT活性變化呈“N”型。自然越冬期間香鱗毛蕨滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)中可溶性蛋白質(zhì)含量變化不明顯，可溶性糖和游離脯氨酸含量呈“N”型變化。自然越冬期間香鱗毛蕨內(nèi)源激素ABA含量隨著溫度的下降而上升，GA3、IAA含量與ABA變化趨勢相反，與溫度呈負相關(guān)。通過觀察香鱗毛蕨葉片越冬期間的超微結(jié)構(gòu)，葉綠體基粒片層逐漸不清晰，但未消失，線粒體隨溫度的降低，脊數(shù)量明顯減少，雙層膜結(jié)構(gòu)破壞嚴重，解體消失。

[1]王建中.東北蕨類植物的分類研究[J].木本植物研究,1989(9): 73-82.

[2]Ito H,Muranaka T,Mori K,et al.Dryofragin and aspidin PB,piscicidal components from Dryopteris fragrans[J].Chem Pharm Bull, 1997,45(10):1720-1722.

[3]沈志濱,金哲雄,張德連,等.香鱗毛蕨治療銀屑病的藥理作用研究[J].中草藥,2002,33(5):448-449.

[4]沈志濱,金哲雄,張德連,等.香鱗毛蕨的生藥學(xué)研究[J].中草藥, 2002,33(7):661-663.

[5]樊銳鋒,黃慶陽,常纓.香鱗毛蕨抑菌特性比較研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2012,43(3):81-84.

[6]Gana J A,Sutton F,Kenefick D G.cDNA structure and expression patterns of a low-temperature-specific wheat gene tacr7[J].Plant Molecular Biology,1997,34:643-650.

[7]Minami A,Nagao M,Ikegami K,et al.Cold acclimation in bryophytes:Low temperature-induced freeing tolerance in Physcomitrella patens is associated with increases in expression levels of stress-related genes but not with increase in level of endogenous abscisic acid[J].Planta,2005,220:414-423.

[8]Liu Y Y,Li J Z,Chen L,et al.Effect of low temperature stress on peroxidation product of membrane lipids and activity of related enzymes in wheat seedling leaves[J].Journal of Triticeae Crops, 2006,26(4):70-73.

[9]湯章誠,魏家綿,陳因,等.現(xiàn)代植物生理學(xué)實驗指南[M].北京:科學(xué)出版社,1999.

[10]陳建勛,王曉峰.植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)[M].廣州:華南理工大學(xué)出版社,2005．

[11]李合生,孫群,趙世杰,等．植物生理生化實驗原理和技術(shù)[M].北京:高等教育出版社,2000.

[12]王晶英,敖紅,張杰,等.植物生理生化實驗技術(shù)與原理[M].哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué)出版社,2003．

[13]吳紅京,張春玲,賴鐘雄.高效液相色譜法測定龍眼胚芽中的細胞分裂素[J].福建分析測試,2005,14(1):2096-2100.

[14]洪濤,姚駿恩,李文鎮(zhèn),等.生物醫(yī)學(xué)超微結(jié)構(gòu)與電子顯微鏡技術(shù)[M].北京:科學(xué)出版社,1984.

[15]周建,尤揚,袁德義.低溫脅迫對廣玉蘭生理特性的影響[J].西北林學(xué)院學(xué)報,2008,23(6):38-42．

[16]沈靜.野牛草響應(yīng)低溫脅迫的生理機制和蛋白質(zhì)組學(xué)初步研究[D].蘭州:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.

[17]戴金平,沈征言.低溫鍛煉對黃瓜幼苗幾種酶活性的影響[J].植物學(xué)報,1991,23(8):627-632.

[18]蔡素雯,郭桂云,張紅梅,等.磁場處理種子后番茄幼苗在低溫脅迫下保護酶的變化[J].植物研究,1996,16(2):219-223.

[19]劉偉,曲凌慧,劉洪慶.低溫脅迫對葡萄保護酶和氧自由基的影響[J].北方園藝,2008(5):21-24.

[20]安瑩,陳雅君,趙偉,等.低溫對白三葉膜質(zhì)過氧化及保護酶活性的影響[J].草原與草坪,2009,13(43):8-11.

[21]崔紅,于晶,蒼晶,等.3個紫斑牡丹品種的抗寒生理特性研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2009,40(7):24-27.

[22]劉洪雨,張吉立,李新,等.低溫對園林植物生物膜及內(nèi)源激素的影響[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué),2011(5):111-113.

[23]楊廣東,郭瑜敏.低溫脅迫對青椒苗期和花期脫落酸含量的影響[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué),1998,26(2):45-48.

[24]沈漫.常春藤質(zhì)膜透性和內(nèi)源激素與抗寒性關(guān)系初探[J].園藝學(xué)報,2005,32(1):141-144.

[25]黃濤,陳大洲,夏凱,等.抗冷與不抗冷水稻在低溫期間葉片ABA與GA1水平變化的差異[J].華北農(nóng)學(xué)報,1998,13(4):56-60.

[26]曲凌慧,車永梅,劉新,等.ABA和IAA等激素參與葡萄對低溫脅迫的應(yīng)答[J].青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2010,27(1):36-41.

[27]趙明明.幾種冬青屬植物抗寒性比較研究[D].南京:南京林業(yè)大學(xué),2012.

[28]韋如萍,胡德活,王潤輝,等.自然低溫條件下南洋楹抗寒生理研究[J].廣東林業(yè)科技,2008,24(1):10-15．

Study onDryopteris fragrans（L.）Schott live through natural winter in Wudalianchi of erdos/

CHANG Ying,LI Yan,AN Yuting,ZHANG Zhimei,WANG Hemeng, ZHANG Wei(School of Life Sciences,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

The overwintering mechanism ofDryopteris fragrans(L.)Schott in Wudalianchi Heilongjiang Province and its physiological and biochemical characteristics as well as ultrastructure were carried out in this study.The results showed thatD.fragransrelative electrical conductivity and content of MDA increased at first and decreased,activity of POD,CAT both generally rised to form into the"N" curve,activity of SOD declined and then increased,content of proline,soluble sugar and soluble protein all presented as the"N"curve.The ratio of ABA/GA3was related closer with low temperature adaptability.The volume of leaf chloroplast expanded into deformation,the granum lamella gradually fuzzied,but not all became collapsed.The number of mitochondria ridge obvious reduced,and double membrane structure were serious destoried.Membrane border fuzzied until they were severely damaged and collapses into disappear finally.

Dryopteris fragrans(L.)Schott;natural overwintering;physiological mechanism;protective enzyme;cold resistance

S828；Q782

A

1005-9369（2014）08-0041-08

2014-03-03

國家自然科學(xué)基金項目（31070291)

常纓（1970-），女，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向為植物資源學(xué)與植物分子生物學(xué)。E-mail:changying@neau.edu.cn

時間2014-7-26 14:32:52[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140726.1432.003.html

常纓,李艷,安玉婷,等.五大連池地區(qū)香鱗毛蕨自然越冬特性研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2014,45(8):41-48.

Chang Ying,Li Yan,An Yuting,et al.Study onDryopteris fragrans(L.)Schott live throughnatural winter in Wudalianchi of erdos[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(8):41-48.(in Chinese with English abstract)