miR-21 在乳腺癌患者血清中的表達(dá)及意義

王貴年 吳 娟

乳腺癌是目前全世界范圍內(nèi)女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅女性身心健康及危害其生命。近年來研究表明，miRNA 功能失調(diào)與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在細(xì)胞的增殖、凋亡、分化等過程中發(fā)揮重要作用，miRNA 成為腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)［1］。迄今，尚無miR -21 在乳腺癌患者血清中確切表達(dá)情況的研究報(bào)道。為此本研究擬通過檢測(cè)乳腺癌患者血清中miR-21 表達(dá)水平，重點(diǎn)探討血清miR-21與乳腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系，為臨床診斷治療乳腺癌提供新的思路。

材料與方法

1.研究對(duì)象:隨機(jī)選取2012 年3 月～2013 年7 月淄博市第一醫(yī)院住院、門診乳腺疾病女性患者共49 例作為研究對(duì)象，其中乳腺良性腫瘤組23 例，患者年齡23 ～65 歲，平均年齡42.15 ±15.73 歲，乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組26 例，年齡25 ～76歲，平均36. 24 ±29. 57 歲，(Ⅰ期9 例、Ⅱ期11 例、Ⅲ期6例)，所有研究對(duì)象均排除妊娠、感染、肝腎功能不全、糖尿病和心腦血管疾病等并發(fā)癥及無其他腫瘤等疾病。本研究中乳腺癌患者病例診斷參照美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)第七版癌癥分期手冊(cè)(cancer staging manual)［2］，全部病例術(shù)前均未行化療或放療，內(nèi)分泌治療。采集研究對(duì)象受試者空腹靜脈血3ml，3500r/min 離心5min，取血清于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.儀器及試劑:ABI Prism7000 熒光定量PCR 儀(Applied bio systems 公司);總RNA 提取試劑盒(QiaGen miReasy Mini Kit)購(gòu)于德國(guó)QiaGen 公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒(U6 snRNA，PCR primer set，has-miR-21，LNATM PCR primer set);實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒(Roche 公司)。

3.血清miR-21 檢測(cè):(1)miR-21 及U6 snRNA 的反轉(zhuǎn)錄:按照總RNA 提取試劑盒說明書對(duì)所有標(biāo)本操作，提取總RNA 后保存于-20℃冰箱中;按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，反轉(zhuǎn)錄前cRNA 總濃度稀釋為5ng/μl，反應(yīng)條件:42℃水浴中溫育60min，合成cDNA 溫育完成后，將此離心管置于95℃空氣浴中加熱樣品5min 取出于-20℃保存。(2)SYBR Green -real-time PCR 法測(cè)定miR -21 表達(dá):總反應(yīng)體系20μl:SYBR Green Mix 9μl，miR - 21 forward primer 2μl，miRNA reverse primer 2μl，template cDNA 2μl，RNase - free H2O 5μl;qRT -PCR 反應(yīng)條件:95℃20s 預(yù)變性;95℃10s、60℃20s，70℃10s采集熒光，40 個(gè)循環(huán)。以U6 snRNA 作為內(nèi)參，并設(shè)置空白對(duì)照，所有標(biāo)本反應(yīng)均設(shè)有3 個(gè)重復(fù)。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各實(shí)驗(yàn)組血清miR -21 濃度比較用秩和檢驗(yàn)(檢驗(yàn)水準(zhǔn)α =0.05);血清miR -21 表達(dá)水平與乳腺癌臨床病理特征之間的相關(guān)性，采用Fisher 精確檢驗(yàn);以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果:陽性曲線和研究對(duì)象血清miR-21 及U6 snRNA 的反應(yīng)曲線呈標(biāo)準(zhǔn)S 型，陰性和空白對(duì)照反應(yīng)曲線呈不規(guī)則型。U6 snRNA 在所有檢測(cè)標(biāo)本中都有表達(dá)，其Ct 值在28.20 ±1.03，可作為本實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參照，說明擴(kuò)增效果滿意，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。

2.乳腺良性腫瘤組、乳腺癌組的血清miR -21表達(dá)水平比較:以△Ct 表示標(biāo)本miR -21 的表達(dá)量，ΔCt=(CtmiR-21-CtU6snRNA)，△Ct 越低說明miR -21表達(dá)量越高，檢測(cè)結(jié)果顯示血清miR -21 的表達(dá)量在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中表達(dá)量遞增，提示血清miR-21 可作為疾病進(jìn)展的指標(biāo)(表1)。

表1 乳腺良性腫瘤組、乳腺癌組的血清miR-21表達(dá)水平比較(△Ct，±s)

表1 乳腺良性腫瘤組、乳腺癌組的血清miR-21表達(dá)水平比較(△Ct，±s)

P 值為與對(duì)照組(乳腺良性腫瘤組)相比

分組 n miR-21(△Ct)P乳腺良性腫瘤組23 4.02 ±1.56Ⅰ期 9 2.11 ±1.02 0.009Ⅱ期 11 1.13 ±0.96 0.005Ⅲ期6 1.01 ±0.53 0.001

2.血清miR -21 的表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系:26 例乳腺癌患者進(jìn)行血清miR-21 定量檢測(cè)，基因表達(dá)變化倍數(shù)采用2-△△Ct法進(jìn)行比較，得出miR-21 相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果符合正態(tài)分布(P ＞0.05)，平均值為0.60 ±0.21，以miR -21 相對(duì)表達(dá)的平均值0.60 為界，將乳腺癌患者分為miR-21低表達(dá)組和高表達(dá)組。乳腺癌組患者血清miR -21相對(duì)表達(dá)量與其年齡(P =0.751)、腫瘤大小(P =0.062)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，乳腺癌組患者血清miR -21 相對(duì)表達(dá)量與TNM 分期(P =0.014)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P =0.021)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，呈正相關(guān)(P ＜0.05)，詳見表2。

表2 血清miR-21 的表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系(n)

討 論

近年來我國(guó)乳腺癌的病死率增長(zhǎng)了38.91%，已成為對(duì)婦女健康威脅最大的疾病之一［3］。目前，缺少乳腺癌的理想血清分子診斷標(biāo)志物，CA153 被作為乳腺癌療效的理想觀察指標(biāo)，但不能作為乳腺癌早期診斷標(biāo)志物［4］。外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞可用來判斷乳腺癌的轉(zhuǎn)移，但早期轉(zhuǎn)移因腫瘤細(xì)胞少而隱蔽，導(dǎo)致陽性率低，限制了其臨床應(yīng)用。隨著基因分子水平檢測(cè)方法的深入研究，乳腺癌發(fā)病機(jī)制取得了部分進(jìn)展，因此應(yīng)用qRT-PCR 法適用于檢測(cè)乳腺癌的血清分子診斷標(biāo)志物［5，6］。

miRNA 是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長(zhǎng)度為19 ～25 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，通過與mRNA 的3'端非翻譯區(qū)(3'untranslated regions，UTRs)進(jìn)行序列特異性的結(jié)合從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)。隨著對(duì)miRNA 研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)miRNA 作為一種新的基因調(diào)控機(jī)制，在腫瘤細(xì)胞增殖、分化等發(fā)揮重要作用，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNA 通過作用于下游基因參與了乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移侵襲及放化療抵抗等，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色［7］。

研究證明，miR -21 是單個(gè)基因編碼miRNA，編碼基因位于17q23.2，miR -21 在膠質(zhì)瘤、肺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)升高，并能通過抑制PTEN、PDCD4、TIMP3、TMP -1、RECK、p53 等抑癌基因的翻譯過程參與調(diào)控多種惡性腫瘤的發(fā)生［8］。目前miR-21 已被證實(shí)在許多類型腫瘤中均表達(dá)異常，雖然已預(yù)測(cè)出許多miR -21 直接調(diào)控的靶基因，但僅部分臨床中得到證實(shí)。2008 年Chen 等通過不同的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miRNA 以一種非常穩(wěn)定的形態(tài)存在于血清，血清miRNA 作為一種非損傷性檢查，在乳腺癌的診斷和預(yù)后判斷方面具有良好的應(yīng)用前景。通過文獻(xiàn)分析，大量研究人員開始關(guān)注循環(huán)miR -21，認(rèn)為血清中升高的miR -21 表達(dá)對(duì)惡性腫瘤的早期診斷、腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤進(jìn)展、對(duì)治療的反應(yīng)和預(yù)后等方面具有預(yù)測(cè)價(jià)值。研究者發(fā)現(xiàn)［9］，相對(duì)于健康成年女性人群，乳腺癌患者血清miR -21 顯著上升，miR -92a 顯著下降，研究成果表明，miR -21 可以作為乳腺癌診斷的血清分子標(biāo)志物。

本研究通過應(yīng)用熒光定量PCR 法對(duì)血清miR -21 表達(dá)水平的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)乳腺癌組明顯高于乳腺良性腫瘤組，提示血清miR -21 可能會(huì)成為乳腺癌患者的診斷參考指標(biāo)，與Kumar 等［10］研究結(jié)果一致。26例乳腺癌組患者血清miR -21 的檢測(cè)結(jié)果與乳腺癌臨床病理特征相關(guān)性初步探討，結(jié)果顯示血清miR - 21 的表達(dá)水平與乳腺癌患者年齡(P =0.751)、腫瘤大小(P =0.062)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，乳腺癌患者血清miR -21 相對(duì)表達(dá)量與TNM 分期(P =0.014)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P =0.021)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，呈正相關(guān)(P ＜0.05)。

為了明確miR -21 與乳腺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，本研究應(yīng)用熒光定量PCR 法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者血清miR -21 高表達(dá)不僅與乳腺癌的發(fā)生有關(guān)，而且其表達(dá)上調(diào)可能會(huì)導(dǎo)致淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，說明miR -21與乳腺癌的轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，miR-21 可能作為一個(gè)腫瘤轉(zhuǎn)移促進(jìn)基因在乳腺癌的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮一定的作用，以上均提示血清miR -21 有望成為未來乳腺癌診斷和治療的一個(gè)新的靶點(diǎn)。

綜上所述，血清miR -21 在乳腺癌診治方面的臨床應(yīng)用價(jià)值存在爭(zhēng)議，因此，血清miR -21 作為乳腺癌潛在的重要分子診斷標(biāo)志物，仍需大樣本的臨床研究支持，以證實(shí)血清miR -21 表達(dá)水平與乳腺癌患者臨床病理因素的相關(guān)性以及評(píng)價(jià)預(yù)后的臨床意義。

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