17β-雌二醇作為擴(kuò)充液對大隱靜脈保護(hù)作用的研究

殷 巍 王 亮 張麗晶 員建平

冠狀動脈旁路移植術(shù)(coronary artery bypass graft，CABG)是目前國際公認(rèn)的最有效的治療冠心病方法之一，在冠狀動脈旁路移植術(shù)中，自體大隱靜脈因其解剖位置表淺，易于游離，取材方便且有足夠的長度，能夠方便地使病變冠狀動脈遠(yuǎn)端的血管與主動脈或其分支連接等優(yōu)點(diǎn)仍然是目前最常用的橋血管替代材料之一。然而，橋血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷從一開始離取、擴(kuò)張和保存血管時就已經(jīng)開始，靜脈橋的損傷導(dǎo)致術(shù)后再狹窄和閉塞嚴(yán)重影響了其遠(yuǎn)期的通暢率，最常見的損傷因素是切取大隱靜脈時通常因?yàn)楦鞣N原因引起痙攣，操作導(dǎo)致的機(jī)械與壓力刺激，引起血管平滑肌局部釋放化學(xué)痙攣因子［1，2］。如何提高術(shù)后近、遠(yuǎn)期通暢率和生存率是當(dāng)今冠脈外科領(lǐng)域的研究難題之一。本課題從CABG 橋血管擴(kuò)充液的方面進(jìn)行研究，目前在國內(nèi)外還未見有對17β -雌二醇(E2)作為擴(kuò)充液的報(bào)道，而17β-雌二醇在擴(kuò)血管和防止搭橋術(shù)后橋血管再狹窄方面及促心肌血管生成作用的研究已經(jīng)得到了證實(shí)［3～8］。本課題為其能否作為新型擴(kuò)充液，減輕橋血管VEC 的損傷提供理論依據(jù)。

材料與方法

1.臨床資料:(1)研究對象:篩選21 例就診于包頭市中心醫(yī)院(2010 年10 月～2011 年11 月)行冠狀動脈旁路移植術(shù)(CABG)的患者，取其冠狀動脈旁路移植術(shù)后剩余的大隱靜脈。(2)入選標(biāo)準(zhǔn):所有患者行CABG 術(shù)前均通過下肢血管超聲檢查顯示均無大隱靜脈橋曲張損害和其他損害。

2.方法:本研究分兩個階段進(jìn)行。第1 階段:篩選21 例行CABG 的患者(考慮到人為取血管手術(shù)技術(shù)不同的對血管損傷因素，本實(shí)驗(yàn)21 例血管均為同一人員所取)取術(shù)前未進(jìn)行擴(kuò)充的大隱靜脈，留下進(jìn)行冠狀動脈旁路移植剩余的血管分割成3 段，每段長約2cm 分為3 組，A 組17β - 雌二醇組(n=21);B 組嬰粟堿組(n=21)和C 組自體血液肝素混合組(n=21)，各組用不同的擴(kuò)充液擴(kuò)充進(jìn)行比較。試驗(yàn)各組取相同擴(kuò)張壓力1000mmHg 擴(kuò)張橋血管，擴(kuò)充時通過靜脈延長管中擴(kuò)張液形成的小液柱推動前端密閉腔中形成的氣體傳導(dǎo)壓力(整個過程中裝置處于同一水平面，并且保證嚴(yán)格無菌操作)壓力表及注射器采用冠狀動脈球囊擴(kuò)張所用上海產(chǎn)壓力注射器一體，擴(kuò)充后的血管按要求分別保存在10%甲醛及3%進(jìn)口戊二醛中，并存放在4℃冰箱保存。擴(kuò)壓表每次用完一組擴(kuò)充液后用生理鹽水沖洗3 遍，用完后用醫(yī)院高溫壓力鍋消毒，整個過程嚴(yán)格保持無菌超作。第2 階段:①擴(kuò)張后將大隱靜脈各切取1cm 經(jīng)石蠟包埋切片后經(jīng)HE 染色和掃描電鏡樣品制備后，并用光鏡和掃描電鏡觀察單位面積血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)的死亡數(shù)目及細(xì)胞器的損傷情況［9］;②取1cm免疫組化標(biāo)記后用光鏡觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)來比較各組擴(kuò)張液血管的損傷情況;③比較3 組擴(kuò)張液擴(kuò)張后大隱靜脈內(nèi)膜VEC 的死亡，以及中膜血管平滑肌的撕裂，通過各組的比較得出對大隱靜脈離取后應(yīng)用擴(kuò)張液對血管內(nèi)膜損傷最小組，在具體的臨床應(yīng)用上能提高大隱靜脈橋的遠(yuǎn)期通暢。

3.觀察血管損害的分級標(biāo)準(zhǔn):(1)光鏡:按內(nèi)皮細(xì)胞脫落的程度分為4 級:每高倍鏡視野下大隱靜脈固有膜表面內(nèi)皮細(xì)胞所占比例＞75%為1 級，50% ～75%為2 級，25% ～50%為3 級，＜25%為4 級［10］。(2)透射電子顯微鏡:取3 組切片標(biāo)本，在電子顯微鏡視野下找出能觀察到的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，應(yīng)用日本HITACHZ H-700H 電子顯微鏡參照細(xì)胞損傷程度分級標(biāo)準(zhǔn)對其超微結(jié)構(gòu)損傷程度進(jìn)行分級［9］(表1)。(3)免疫組化法:檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM -1)的比較來觀察各組應(yīng)用擴(kuò)張液血管前后的情況。13 點(diǎn)評分法是以0 ～4 分來判定陽性細(xì)胞的百分比:0 分，沒有陽性細(xì)胞;1 分，陽性細(xì)胞百分比＜10%;2 分，陽性細(xì)胞百分比＞10%但＜50%;3 分，陽性細(xì)胞百分比＞50%但＜80%;4 分，陽性細(xì)胞百分比＞80%。染色強(qiáng)度按陰性、弱、中、強(qiáng)染色分別評為0 ～3 分(染成棕黃色為陽性細(xì)胞)。最終的評分是指標(biāo)的乘積［11］。

表1 細(xì)胞損傷程度分級標(biāo)準(zhǔn)

結(jié) 果

應(yīng)用17β -雌二醇和罌粟堿組作為擴(kuò)充液擴(kuò)充后的血管通過光鏡觀察藥物擴(kuò)張后的大隱靜脈內(nèi)皮細(xì)胞脫落較少，1 ～2 級占95%，管壁固有膜，肌層細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞變性較少(表2，圖1)。而自體血肝素混合組作為擴(kuò)充液擴(kuò)充后的大隱靜脈內(nèi)皮細(xì)胞大量脫落，Ⅱ～Ⅲ級占90%，固有膜細(xì)胞水腫明顯，肌層細(xì)胞出現(xiàn)黏液變性及肌纖維變性(表2，圖1)。血管免疫組化及電鏡結(jié)果觀察損傷最小，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各組損傷分級差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。應(yīng)用17β-雌二醇和罌粟堿組作為擴(kuò)充液擴(kuò)充后的血管通過透射電鏡觀察藥物擴(kuò)張后的大隱靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)各細(xì)胞器較為清晰、完整，按照細(xì)胞超微分級標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ～Ⅲ級占70%以上，而自體血肝素混合組作為擴(kuò)充液擴(kuò)充后的大隱靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損害、自溶現(xiàn)象較多，超微結(jié)構(gòu)各細(xì)胞器模糊不清有的甚至消失，分級標(biāo)準(zhǔn)Ⅲ～Ⅳ級占70%以上(表3、表4，圖2、圖3)。

表2 光鏡結(jié)果

圖1 HE 染色實(shí)驗(yàn)照片(×200)

表3 內(nèi)皮細(xì)胞電鏡結(jié)果數(shù)量統(tǒng)計(jì)(n)

表4 平滑肌細(xì)胞電鏡結(jié)果數(shù)量統(tǒng)計(jì)(n)

圖2 免疫組化實(shí)驗(yàn)照片(×100)

圖3 內(nèi)皮細(xì)胞透射電子顯微鏡照片(×15000)

應(yīng)用17β-雌二醇組作為擴(kuò)充液擴(kuò)充后的血管通過免疫組化(ICAM-1)檢測觀察陽性表達(dá)最少，按國際上通用13 點(diǎn)評分標(biāo)準(zhǔn)基本在1 分，而自體血肝素混合組作為擴(kuò)充液擴(kuò)充后的血管通過免疫組化(ICAM-1)檢測觀察陽性表達(dá)最多，按國際上通用13 點(diǎn)評分標(biāo)準(zhǔn)基本在6 分(表5，圖4)。

表5 免疫組化(ICAM-1)

討 論

圖4 平滑肌細(xì)胞透射電子顯微鏡照片(×15000)

CABG 手術(shù)目前仍是治療冠心病最主要的方法之一。然而，術(shù)后橋血管的再狹窄仍是當(dāng)今困擾全世界心臟外科的一大難題。如何提高術(shù)后遠(yuǎn)期通暢率和生存率是當(dāng)今冠脈外科領(lǐng)域的研究難題之一。橋血管離取過程中的過分牽拉，過高的擴(kuò)張壓力將直接導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的脫落，甚至中膜血管平滑肌的撕裂。為了防止高壓擴(kuò)張血管后所帶來的損害，目前國內(nèi)外在取完橋血管后常打入的擴(kuò)充液主要為嬰粟堿液，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究的有硝酸甘油- 維拉帕米液等［10～13］。Liu 等［14］研究指出，擴(kuò)張時生理所能承受的壓力范圍可能為100 ～600mmHg。本課題從CABG橋血管擴(kuò)充液的方面進(jìn)行研究，為尋求新型擴(kuò)充液，減輕橋血管VEC 的損傷，提高CABG 術(shù)后橋血管遠(yuǎn)期的通暢率提供理論依據(jù)。實(shí)驗(yàn)前也通過預(yù)實(shí)驗(yàn)得出相同結(jié)論，擴(kuò)張壓力＜1000mmHg 時，血管的損傷較小，不容易比較血管的損傷的情況，因此本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)充血管的擴(kuò)張壓力選擇1000mmHg。

通過本研究光鏡結(jié)果表明，應(yīng)用17β -雌二醇為擴(kuò)充液的大隱靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷最小，罌粟堿組次之，自體血肝素混合組損傷最大，其原因?yàn)?7β -雌二醇和罌粟堿組在擴(kuò)充血管時通過其舒血管的機(jī)制，有效的防止了大隱靜脈的痙攣，使血管壁平滑肌舒張使整個血管均勻性擴(kuò)張，靜脈管壁具有彈性，質(zhì)地較韌，內(nèi)皮細(xì)胞脫落較少，肌層細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞變性較少。17β-雌二醇組優(yōu)于罌粟堿組其原因可能為17β-雌二醇存在擴(kuò)血管的機(jī)制多于罌粟堿:17β -雌二醇從基因組和非基因組均存在舒血管機(jī)制，具體如下:①雌激素從基因組開始阻礙腺苷酸環(huán)化酶(cAMP)或鳥苷酸環(huán)化酶(cGMP)的激活，減少其的縮血管的機(jī)制進(jìn)而達(dá)到其舒血管的目的;②非基因組舒血管機(jī)制通過內(nèi)皮依賴和非內(nèi)皮依賴發(fā)揮其作用。當(dāng)17β-雌二醇濃度為10-9～10-6mol/L 時，其通過內(nèi)皮型促進(jìn)一氧化氮合酶(eNOS)等作用激活鳥甘酸環(huán)化酶(GC)，增加細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)等機(jī)制，進(jìn)而激活蛋白激酶G(PKG)及K+通道的開放，最終達(dá)到舒張血管平滑肌的作用;當(dāng)17β -雌二醇濃度＞10-5mol/L 時，其舒血管作用通過非內(nèi)皮依賴，其機(jī)制是阻斷血管平滑肌細(xì)胞膜上兩種鈣通道進(jìn)而阻斷所有類型的鉀離子通道達(dá)到舒血管目的。而傳統(tǒng)罌粟堿舒血管機(jī)制少于雌激素，且罌粟堿液對血管存在多種不利因素:①罌粟堿溶液損傷血管內(nèi)皮超極化因子(EDHF)介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張，增加了血管的張力;②其酸性pH 值(pH 5. 0)，會進(jìn)一步損傷VEC 可引起抗血小板聚集，筆者實(shí)驗(yàn)觀察到對血管的擴(kuò)充及保護(hù)作用不如17β -雌二醇組。而自體血肝素混合組擴(kuò)充血管為純暴力克服大隱靜脈痙攣，引起血管平滑肌局部釋放化學(xué)痙攣因子，內(nèi)皮細(xì)胞大量脫落，內(nèi)皮脫落，固有層細(xì)胞水腫明顯，肌層細(xì)胞出現(xiàn)黏液變性及肌纖維變性，通過筆者的實(shí)驗(yàn)觀察血管損傷最大，這一點(diǎn)與國內(nèi)外其他研究一致。

通過本研究透射點(diǎn)鏡觀察結(jié)果表明，應(yīng)用17β -雌二醇作為擴(kuò)充液擴(kuò)充后的血管通過透射電鏡觀察藥物擴(kuò)張后的大隱靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)各細(xì)胞器較為清晰、完整，罌粟堿組次之，自體血肝素混合組損傷最大。其原因除了17β -雌二醇上述舒血管機(jī)制減少細(xì)胞損傷外，還可能與雌激素通過誘導(dǎo)凋亡抑制基因bcl -2mRNA 表達(dá)，進(jìn)而增加bcl-2 蛋白合成，誘導(dǎo)c-myc 編碼的蛋白質(zhì)，抑制平滑肌增殖發(fā)生凋亡，筆者的實(shí)驗(yàn)觀察到17β -雌二醇組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)各細(xì)胞器較為清晰、完整。本實(shí)驗(yàn)的電鏡結(jié)果顯示，酸性罌粟堿溶液損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮超微結(jié)構(gòu)與文獻(xiàn)報(bào)道是一致的。另外通過本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)利用透射電鏡結(jié)合對血管內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)展開研究，具有準(zhǔn)確、直觀，既可定量又可定性研究的優(yōu)點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，17β -雌二醇組作為擴(kuò)充液擴(kuò)充后的血管通過免疫組化(ICAM -1)檢測觀察陽性表達(dá)最少，ICAM -1 是目前認(rèn)識的黏附分子主要有細(xì)胞間黏附分子-1，在多種血管性疾病病理變化，如炎癥有關(guān)的疾病、血管損傷性疾病以及缺血再灌注性損傷等多種病理?xiàng)l件下，皆可發(fā)生中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，其黏附正是由細(xì)胞表面的ICAM-1 等黏附分子介導(dǎo)的，且ICAM -1 在白細(xì)胞對內(nèi)皮的緊密黏附中起關(guān)鍵作用，二者的結(jié)合導(dǎo)致中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附，成為內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能障礙的基礎(chǔ)。中性粒細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞在病理?xiàng)l件下，還可以釋放一些細(xì)胞因子，如TNF -α、IL -1 等，由此引起缺血后的炎癥反應(yīng)。同時這些炎癥細(xì)胞因子又可以增加內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)，促進(jìn)二者的黏附，加重內(nèi)皮細(xì)胞損傷。黏附的中性粒細(xì)胞還可以通過釋放一些彈性蛋白酶來損傷內(nèi)皮細(xì)胞，同時，中性粒細(xì)胞的活化和穿入會引起組織的炎性損傷，會導(dǎo)致組織的重構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)可以得出17β-雌二醇作為擴(kuò)充液組血管ICAM -1 陽性表達(dá)最少，可以得到其對血管損傷最小，推測擴(kuò)充液從理論上應(yīng)增加橋血管遠(yuǎn)期通暢性。

本課題應(yīng)用17 -β 雌二醇作為擴(kuò)充液與傳統(tǒng)擴(kuò)充液在相同擴(kuò)充壓力下對靜脈橋損傷的對應(yīng)比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在臨床中選取17 -β 雌二醇作為擴(kuò)充液對大隱靜脈損傷最小，為其應(yīng)用在臨床冠狀動脈旁路移植術(shù)中提供了理論依據(jù)，但其在臨床工作中保持橋血管通暢性的效果還需要臨床試驗(yàn)進(jìn)行論證及進(jìn)一步研究。

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