低氧下動(dòng)脈粥樣硬化大鼠KLF2 和eNOS 基因表達(dá)差異的研究

盧東東 周白麗

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種常見的動(dòng)脈血管硬化性疾病，其病變主要累及體循環(huán)系統(tǒng)的大中型肌彈力型動(dòng)脈。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展及人們生活方式的改變，動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。而近年來的研究發(fā)現(xiàn)KLF2 參與血管內(nèi)皮功能的調(diào)節(jié)對維持血管內(nèi)環(huán)境的平衡有著重要的作用，且KLF2 可通過上調(diào)血管保護(hù)性因子及下調(diào)血管炎性因子的表達(dá)參與血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)［1～3］。眾所周知，eNOS 在血管生成和血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移扮演著重要的角色，它可催化血管內(nèi)皮生成一氧化氮(NO)，對維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能有著重要的作用［4］。近年來對低氧下細(xì)胞功能和細(xì)胞信號的研究成為低氧生理研究的熱點(diǎn)，青藏高原平均海拔在4000 米以上，高原缺氧條件下動(dòng)脈粥樣硬化的病理生理與平原地區(qū)有一定的差異。目前有關(guān)急性缺氧下動(dòng)脈粥樣硬化的研究較少，本課題使用低壓氧艙模擬急性缺氧環(huán)境，通過研究不同急性缺氧時(shí)間下兩組大鼠主動(dòng)脈中KLF2 和eNOS 的表達(dá)的差異，探討KLF2 在低氧條件下對細(xì)胞內(nèi)皮功能的影響。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及主要儀器:(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:雄性健康Wistar 大鼠47 只，由蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號:0002511)。(2)主要試劑:牛血白蛋白、尼古丁(北京久峰潤達(dá)生物技術(shù)有限公司)、維生素D3(大連美侖生物技術(shù)有限公司)、卵清白蛋白(美國Sigma 公司)、RNA 快速提取試劑盒(北京久峰潤達(dá)生物技術(shù)有限公司)、cDNA 第一鏈合成試劑盒(北京天恩澤基因科技有限公司)、Taq DNA 聚合酶(北京天恩澤基因科技有限公司)、KLF -2、eNOS、GAPDH 引物(德國QIAGEN 公司QuaintTect?Primer Assay，貨號分別為:QT01294272、QT00414085、QT00199633。注:具體引物序列因涉及知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)，QIAGEN 公司未提供具體引物序列);(3)實(shí)驗(yàn)儀器:低溫超速離心機(jī)(德國Eppendorf-5424R)、全自動(dòng)生化分析儀(德國羅氏Modular DPP)、PCR 儀(德國Eppendorf Master- cycler PCR 儀)、凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio - Rad 公司)、OLYMPUS 光學(xué)顯微鏡等。

2.動(dòng)脈粥樣硬化造模及分組:實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為兩組(造模組23 只、對照組24 只。因西寧地處青藏高原東北部，平均海拔2260 米，故未放入低壓氧艙大鼠均為慢性缺氧大鼠)。造模組給予:牛血白蛋白32mg/kg 尾靜脈注射，3 次/周，共9次;卵清白蛋白2.5mg/kg 腹腔注射，1 次/3 日，共5 次;維生素D325 萬U/kg 灌胃，連續(xù)3 天。參考王園園等［5］關(guān)于大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型建立和評價(jià)的方法;尼古丁1mg/kg 腹腔注射，共2 周。參考Lou 等［6］血管內(nèi)皮損傷模型造模方法;同時(shí)給予高脂飼料(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供:豬油16.2%、蔗糖10.8%、酪蛋白9.6%、膽固醇1.3%、膽鹽0.3%、甲基硫氧嘧啶0.1%)喂養(yǎng)，不限飲水。對照組給予同等量生理鹽水處理、給予普通飼料喂養(yǎng)，不限飲水。

3.血脂檢測:分別于造模開始前、造模6 周、造模12 周經(jīng)大鼠尾靜脈取血約0.5ml，離心后取上清，于-80℃保存，采血結(jié)束后同時(shí)送至青海省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科使用全自動(dòng)生化儀檢測總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)水平。

4.急性缺氧模型:于造模結(jié)束后分別在造模組和對照組中隨機(jī)選取15 只大鼠，同時(shí)放入青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院高原醫(yī)學(xué)中心低壓氧艙，設(shè)定時(shí)間分別為4、8、12h，分別為急性缺氧4、8、12h 造模組和急性缺氧4、8、12h 對照組，未放入低壓氧艙大鼠為急性缺氧0h 組(既慢性缺氧組，分別為慢性缺氧造模組和慢性缺氧對照組)，設(shè)定艙內(nèi)海拔為5000 米，模擬高海拔低壓低氧環(huán)境，到達(dá)設(shè)定時(shí)間后取出大鼠及時(shí)處死，留取標(biāo)本。

5.主動(dòng)脈形態(tài)觀察:處死動(dòng)物后取主動(dòng)脈，剝離外膜脂肪組織，取胸主動(dòng)脈約1cm，切成0.3cm 小段，放入10%中性甲醛溶液中固定過夜，常規(guī)脫水、石蠟包埋，連續(xù)切片，每個(gè)標(biāo)本取3 張切片，經(jīng)HE 染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察主動(dòng)脈形態(tài)。

6.半定量RT -PCR 檢測KLF2、eNOS、GAPDH 基因的表達(dá):處死動(dòng)物后，取主動(dòng)脈，于-80℃保存。使用RNA 快速提取試劑盒提取大鼠主動(dòng)脈組織中總RNA，溶于DEPC 水中，測定OD260/280 比值為1.85 ～1.96。取1.0μg 總RNA，用cDNA 第1 鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，取1μl 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物行PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性4min、94℃變性30s、60℃退火45s、72℃延伸1min、72℃最終延伸10min，共35 次循環(huán)。PCR 結(jié)束后取10μl 反應(yīng)產(chǎn)物在1.7%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)下拍照，用Image J 軟件分析各條帶灰度值。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:使用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.大鼠不同時(shí)期血脂水平比較:造模6 周時(shí)造模組大鼠血清TC、TG、HDL、LDL 含量明顯高于同時(shí)期對照組(P ＜0.05);造模6 周時(shí)造模組大鼠血清TC、TG、HDL、LDL 含量明顯高于造模前造模組大鼠(P ＜0.05);造模12 周時(shí)造模組大鼠血清TC、TG、LDL 含量明顯高于同時(shí)期對照組(P ＜0.05);造模12 周時(shí)造模組大鼠血清TC、TG、LDL 含量明顯高于造模前及造模6 周大鼠(P ＜0.05)，詳見表1。

表1 兩組大鼠不同時(shí)期血脂水平的比較(mmol/L)

2.大鼠主動(dòng)脈形態(tài)觀察(圖1):光鏡下，對照組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑完整，內(nèi)皮細(xì)胞無增生，中膜平滑肌細(xì)胞、彈力纖維排列整齊連續(xù)、無中斷;慢性持續(xù)缺氧造模組大鼠動(dòng)脈內(nèi)膜呈現(xiàn)不均一增厚，內(nèi)膜細(xì)胞排列紊亂，中膜平滑肌細(xì)胞排列紊亂，中層彈力纖維鈣化明顯，排列紊亂，有不同程度的斷裂和破壞，部分嚴(yán)重鈣化，凸向血管腔，有少量泡沫細(xì)胞聚集;急性缺氧12h 造模組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增生，內(nèi)膜增厚明顯，細(xì)胞排列紊亂，血管腔面不光整，血管中膜纖維組織增生，并有大量細(xì)胞碎片及鈣化組織沉積，凸向血管腔。

3.半定量RT-PCR 檢測大鼠KLF2、eNOS、GAPDH 基因的表達(dá):(1)造模組大鼠給予急性缺氧4、8h處理后，造模組大鼠KLF2 表達(dá)水平明顯高于相同急性缺氧時(shí)間對照組(P ＜0.05);造模組大鼠急性缺氧12h 組KLF2 表達(dá)水平明顯低于慢性缺氧造模組和急性缺氧4h 造模組(P ＜0.05);慢性缺氧造模組大鼠KLF2 表達(dá)水平高于慢性缺氧對照組大鼠(P ＜0.05);急性缺氧12h 造模組組與急性缺氧12h 對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)。(2)造模組大鼠給予急性缺氧4、8h 處理后，造模組大鼠eNOS 表達(dá)水平明顯高于相同缺氧時(shí)間對照組(P ＜0.05);急性缺氧缺氧12h 對照組eNOS 表達(dá)水平明顯高于慢性缺氧對照組和急性缺氧4h 對照組(P ＜0.05);慢性缺氧造模組大鼠eNOS 表達(dá)水平明顯高于慢性缺氧對照組(P ＜0.05)，詳見表2，圖2、圖3。

圖1 不同缺氧時(shí)間動(dòng)脈粥樣硬化大鼠主動(dòng)脈病理改變(HE 染色，10 ×40)

表2 兩組大鼠不同急性缺氧時(shí)間KLF2、eNOS、GAPDH 的表達(dá)

圖2 兩組大鼠不同缺氧時(shí)間KLF2、eNOS、GAPDH 表達(dá)的比較

討 論

圖3 兩組大鼠不同缺氧時(shí)間KLF2、eNOS 的表達(dá)水平比較

KLFs 是鋅指樣轉(zhuǎn)錄因子家族的總稱，是已經(jīng)被證明了在多種細(xì)胞類型和器官系統(tǒng)中能廣泛調(diào)節(jié)多種生理學(xué)和病理學(xué)過程的轉(zhuǎn)錄因子之一［7］。值得注意的是，在過去10 年的研究中認(rèn)為KLFs 在多種細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)、巨噬細(xì)胞以及平滑肌細(xì)胞(SMCs)中可作為AS 的保護(hù)因子［8］。KLF2 是KLFs家族成員之一，它在內(nèi)皮細(xì)胞以及與內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞中高表達(dá)并充當(dāng)“分子開關(guān)”的作用，因其在內(nèi)皮細(xì)胞中起著抗炎、抗血栓形成、舒張血管、抗血小板的功能而發(fā)揮維持血管內(nèi)皮功能平衡的作用［9］。eNOS 是一氧化氮合酶(NOS)3 種亞型之一，它可催化血管內(nèi)皮生成一氧化氮(NO)協(xié)調(diào)血管內(nèi)皮功能［4］。有文獻(xiàn)報(bào)道隨著急性缺氧時(shí)間的延長，eNOS在對照組大鼠中的表達(dá)逐漸增高，提示eNOS 在血管內(nèi)的活化機(jī)制可能還有低氧的刺激有關(guān)［10］。

AS 的發(fā)病機(jī)制包括血管內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞功能異常、白細(xì)胞浸潤及其促炎作用的激活等方面，有研究發(fā)現(xiàn)在AS 小鼠中KLF2 表達(dá)是減少的［11］。其中的兩個(gè)基因eNOS 和血栓調(diào)節(jié)蛋白已經(jīng)被證實(shí)與KLF2 監(jiān)管和啟動(dòng)子區(qū)域相關(guān)［1～3］。低層流條件可誘導(dǎo)KLF2 的表達(dá)，從而導(dǎo)致下調(diào)炎性基因如血管細(xì)胞黏附因子(VCAM)和E-選擇素的表達(dá)，并上調(diào)血管保護(hù)性基因如內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶(eNOS)表達(dá)［1～3，12，13］。KLF2 通 過 募 集cAMP 途 徑 效 應(yīng) 因 子CBP/300 轉(zhuǎn)錄共激活因子調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與活化［2］。本研究中KLF2 高表達(dá)的大鼠eNOS 的表達(dá)也是升高的，與Lin 等的研究的結(jié)果相一致。同時(shí)KLF2 可通過感應(yīng)動(dòng)脈粥樣硬化血管血流動(dòng)力學(xué)剪切應(yīng)力的變化調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥效應(yīng)的活化效應(yīng)，抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成［14］。

高原缺氧對人體多個(gè)系統(tǒng)包括心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等功能發(fā)生改變。在缺氧環(huán)境下，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性較常氧條件有所下降。張司蘭等［15］的研究指出在低壓低氧條件下，多個(gè)導(dǎo)致斑塊穩(wěn)定性下降的基因表達(dá)量升高，導(dǎo)致低壓低氧條件下動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性下降。同時(shí)呂云輝等［16］的研究提示在低壓低氧狀態(tài)下，AS 斑塊的穩(wěn)定性下降，而心血管系統(tǒng)受到低氧、高二氧化碳等刺激時(shí)，自主神經(jīng)的活性增加，通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮分泌多種血管活性物質(zhì)來調(diào)節(jié)血管張力，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能和血管張力發(fā)生變化，從而可引起動(dòng)脈硬度和血壓的變化。由此可知在低氧條件對AS 斑塊的穩(wěn)定性等各方面有一定的影響，本實(shí)驗(yàn)中觀察到急性缺氧12h 造模組動(dòng)脈粥樣硬化病變較慢性缺氧造模組嚴(yán)重，提示急性缺氧條件可加重AS 病變的嚴(yán)重程度。

KLF2 和eNOS 對維持血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的穩(wěn)定有著重要的作用，是血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)因子。Hae-Young 等［17］研究發(fā)現(xiàn)FOXO1 是一個(gè)負(fù)向調(diào)節(jié)KLF2 表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子，并指出Fox 轉(zhuǎn)錄因子- 1(FOXO1)通過抑制對血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)因子的表達(dá)從而引起血管內(nèi)皮功能的損害。提示KLF2、eNOS 可能通過FOXO1 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控參與了血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。有研究提示，與常氧條件相比，在低氧條件下骨髓間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)FOXO1 的表達(dá)是升高的［18］。但是在急性缺氧條件下動(dòng)脈粥樣硬化大鼠主動(dòng)脈組織中KLF2 表達(dá)量的改變是否與FOXO1 途徑相關(guān)還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

筆者的研究結(jié)果表明，急性缺氧條件能刺激對照組大鼠eNOS 的表達(dá)，從而發(fā)揮血管內(nèi)皮功能調(diào)節(jié)的作用，且隨著急性缺氧時(shí)間的延長，對照組大鼠主動(dòng)脈中eNOS 的表達(dá)逐漸增高。同時(shí)我們的研究發(fā)現(xiàn)慢性持續(xù)缺氧造模組KLF2 表達(dá)水平明顯高于慢性持續(xù)缺氧對照組，而在急性缺氧條件下，造模組KLF2表達(dá)水平逐漸下降尤其在急性缺氧12h 組，KLF2 表達(dá)水平明顯低于慢性持續(xù)缺氧條件，說明急性的缺氧刺激能抑制動(dòng)脈粥樣硬化大鼠中KLF2 基因的激活從而導(dǎo)致KLF2 表達(dá)水平的降低，提示KLF2 在急性缺氧條件下也參與了動(dòng)脈粥樣硬化血管組織中內(nèi)皮細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，慢性持續(xù)缺氧條件能刺激動(dòng)脈粥樣硬化大鼠中KLF2 的表達(dá)，但其具體的機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究探討。這些可能為在低氧下研究動(dòng)脈粥樣硬化的特殊病理生理提供新的研究思路和提示。

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