模擬海拔5000 米高原低氧環(huán)境對(duì)大鼠腎臟氧化應(yīng)激和NADPH 氧化酶的影響

石 麗 王穎超 羅朋力

高海拔缺氧可以造成循環(huán)血中氧分壓或氧含量下降致使組織細(xì)胞供氧不足，產(chǎn)生一系列病理狀態(tài)。缺氧發(fā)生后，腎臟是容易受損的器官，高原急性缺氧所致腎損傷進(jìn)一步引起急性腎功能障礙，甚至多器官功能障礙及衰竭［1～3］。既往研究表明，氧化應(yīng)激是高原急性缺氧時(shí)腎臟損傷的重要機(jī)制之一，而NADPH氧化酶的激活則是機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激的重要原因［4～6］。筆者通過復(fù)制大鼠腎臟高原急性缺氧損傷模型，通過檢測(cè)腎組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的變化及急性缺氧后不同時(shí)程點(diǎn)大鼠腎臟NOX4 和P47phox 蛋白水平的表達(dá)變化，為有效預(yù)防腎臟缺氧損傷提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑:7 周齡健康清潔級(jí)SD 大鼠60 只，均為雄性，體重180 ～200g，由蘭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):0002511)，經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)兩周后用于實(shí)驗(yàn)。超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)試劑盒由南京建成生物工程研究所提供;);NOX4 和P47phox 一抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，1∶2000);β-actin 單克隆抗體(美國(guó)Sigma 公司，1∶2000);二抗(DAK 公司，1∶2000)

2.實(shí)驗(yàn)方法:(1)復(fù)制急性缺氧動(dòng)物模型:使用青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院高原醫(yī)學(xué)研究中心低壓氧艙模擬海拔5000 米高原低氧環(huán)境復(fù)制動(dòng)物模型，將大鼠按照進(jìn)入低壓氧艙的時(shí)間分為0.5、1、3、5、7 天，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組(西寧地區(qū))等6 個(gè)組。(2)血液血肌酐、尿素氮測(cè)定:大鼠腹主動(dòng)脈采血，3000r/min、15min 離心，離心后吸取上清液，取血清保存于-80℃冰箱里備用。用生化儀來測(cè)定血尿素氮(Bun)和血肌酐(Scr)水平。(3)氧化指標(biāo)SOD、MDA 測(cè)定:嚴(yán)格按試劑盒說明書，測(cè)定腎臟組織中SOD、MDA 含量。(4)腎臟NOX4、P47phox 蛋白含量:Western blot 法檢測(cè)腎臟組織NOX4、P47PHOX 蛋白的表達(dá)。取腎臟組織200mg，提取組織蛋白以BCA 蛋白分析法測(cè)蛋白濃度。電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，封閉1h，加入一抗和β-actin 單克隆抗體，4℃過夜，二抗室溫孵育1h，洗滌，ECL顯示條帶。

結(jié) 果

1.大鼠血肌酐、尿素氮改變:隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠肌酐及尿素氮水平呈先升高后下降的趨勢(shì)(圖1)。

圖1 大鼠不同缺氧時(shí)間血清肌酐、尿素氮濃度變化

2.氧化相關(guān)指標(biāo)變化:腎臟SOD 水平一直下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，MDA 表達(dá)水平總體呈升高趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05，圖2)。

3.蛋白表達(dá)變化:大鼠腎臟NOX4 及P47phox 蛋白表達(dá)均隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)而開始升高，于5 天后開始降低，7 天恢復(fù)大致正常水平(圖3)。

討 論

圖2 大鼠不同缺氧時(shí)間腎臟SOD、MDA 的表達(dá)變化

圖3 大鼠不同時(shí)程腎臟蛋白表達(dá)變化

機(jī)體處于高海拔環(huán)境會(huì)引發(fā)一系列連鎖反應(yīng)，在生理、心理和行為等各層次都會(huì)發(fā)生一定變化［5～10］。本研究利用低壓氧艙模仿高原5000 米缺氧環(huán)境，實(shí)驗(yàn)條件可以模仿高原缺氧環(huán)境，通過比較不同時(shí)間內(nèi)氧分壓和動(dòng)脈血氧飽和度下降程度，來觀察全身各個(gè)器官的功能、甚至結(jié)構(gòu)的變化，其中腎臟對(duì)缺氧很敏感。既往研究表明，氧化應(yīng)激在缺氧所致腎損傷中起著重要作用［5～7］。所謂氧化應(yīng)激是由于人體新陳代謝過程中產(chǎn)生的“自由基”產(chǎn)生過多，超過了正常組織的抗氧化防御系統(tǒng)。高原缺氧狀態(tài)可導(dǎo)致氧化應(yīng)激增加和機(jī)體的抗氧化功能下降，是引發(fā)急性腎衰竭等多種疾病的重要原因。

本研究通過對(duì)血清肌酐、尿素氮濃度的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)肌酐、尿素氮自缺氧12h 就開始升高，5 天后開始下降。說明高原缺氧狀態(tài)確實(shí)對(duì)大鼠腎臟造成一定程度的損傷，之后其濃度的下降，可能是機(jī)體對(duì)高原缺氧環(huán)境的逐漸習(xí)服過程。通過觀察腎臟高原急性缺氧時(shí)SOD、MDA 水平變化，表明高原缺氧對(duì)腎臟造成的損傷機(jī)制，可能是由于腎細(xì)胞及器官水平缺氧造成SOD 活力下降、MDA 水平升高，腎組織清除氧自由基的能力下降，從而使機(jī)體產(chǎn)生極多氧自由基和各種蛋白水解酶、炎性物質(zhì)，進(jìn)一步發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。相關(guān)研究表明，過多ROS 產(chǎn)生使機(jī)體抗氧化能力下降，氧化/還原動(dòng)態(tài)失衡，造成機(jī)體蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等的氧化損傷，使機(jī)體處于一種嚴(yán)重的應(yīng)激狀態(tài)［4～7］。ROS 是由氧激發(fā)的化學(xué)性質(zhì)十分活潑的分子，近年來研究顯示，NADPH 氧化酶的過度活化可能是細(xì)胞內(nèi)ROS 高表達(dá)的重要原因，它在炎癥和腎損傷等疾病中發(fā)揮重要作用，P47phox 和NOX4 等亞基則是激活NADPH 氧化酶的關(guān)鍵亞基，可能會(huì)進(jìn)一步介導(dǎo)ROS 產(chǎn)生，使機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激［3～6］。本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定P47phox 和NOX4 兩個(gè)亞基蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，可能隨著機(jī)體對(duì)氧化應(yīng)激的適應(yīng)，缺氧后期表達(dá)量有所下降?？梢酝茰y(cè)高原缺氧可能誘導(dǎo)了NADPH 氧化酶的表達(dá)，造成腎臟病理損傷。因此通過抑制NADPH氧化酶的活性可有效的降低ROS 的產(chǎn)生，從而減輕高原急性缺氧所引起的腎臟病變。

總之，本結(jié)果模擬在低壓氧艙急性缺氧的病理過程中，NADPH 氧化酶可能起到重要作用，因此對(duì)NADPH 氧化酶的抑制尤為重要。缺氧腎臟損傷的發(fā)生涉及很多復(fù)雜因素，本研究從一個(gè)側(cè)面推測(cè)了高原缺氧所致腎損傷的發(fā)病機(jī)制，為進(jìn)一步探討高原環(huán)境下防治腎損傷提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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