經(jīng)典恒溫加速試驗(yàn)法預(yù)測(cè)健腦益智膠囊的有效期

柳小莉 趙曉平 范小璇 侯 文 郭東艷

健腦益智膠囊為陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，處方由水蛭、葛根、白茅根、郁金等藥味組成。具有化瘀利水，豁痰開(kāi)竅的功效，臨床上主要用于顱腦損傷后腦組織水腫和微循環(huán)障礙引起的各種癥狀。其中水蛭為方中君藥，有效成分為水蛭素，水蛭素遇熱不穩(wěn)定，《中國(guó)藥典》2010 年版一部水蛭項(xiàng)下采用抗凝血酶活性進(jìn)行定量。因處方中干擾因素較多，不能準(zhǔn)確測(cè)定其抗凝效價(jià)的變化，因而選用臣藥葛根中的有效成分葛根素為指標(biāo)成分［1，2］，采用經(jīng)典恒溫加速試驗(yàn)法及高效液相色譜法對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定，預(yù)測(cè)健腦益智膠囊的有效期。

材料與方法

1.儀器:Agilent 高效液相層析儀(美國(guó)安捷倫公司);Al204萬(wàn)分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);BT25s 十萬(wàn)分之一電子天平(上海天美儀器有限公司);501 型超級(jí)恒溫水浴鍋(上海實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);KH-400KDE 型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。

2.藥材與試劑:健腦益智膠囊(陜西中醫(yī)學(xué)院中藥制劑室自制，批號(hào)為20120819);葛根素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定研究院，供含量測(cè)定用，批號(hào)為110752 -200511);甲醇為層析純;水為重蒸餾水。

3.方法:(1)取樣:取健腦益智膠囊150 粒，分成25 份，將各份樣品置具塞試管中密封，分別放于60、70、80、90、100℃超級(jí)恒溫水浴鍋中，按各設(shè)定時(shí)間取出，立即放入水中冷卻，備用。(2)葛根素含量測(cè)定方法學(xué)考察:層析條件:層析柱為Thermo BDS C18(5μm，4.6 ×250nm)，以甲醇-水(25∶75)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)250nm;流速為1. 0ml/min;柱溫為25℃。(3)對(duì)照品溶液的制備:取對(duì)照品0.87mg，精密稱定，加30%乙醇制成每1ml 含87μg 的溶液，即得。(4)供試品溶液的制備:取上述的具塞試管中健腦益智膠囊內(nèi)容物約1.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入30%乙醇50ml，密塞，稱定重量，超聲處理30min，放冷，再稱定重量，用30%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，用0.45μm 微孔濾膜濾過(guò)，即得。(5)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:精密吸取對(duì)照品溶液(87μg/ml)3ml，定容至10ml 容量瓶中。分別精密吸取2、4、6、8、10、12μl注入液相層析儀，按照優(yōu)選的層析條件進(jìn)行測(cè)定，以對(duì)照品溶液進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。

結(jié) 果

1.葛根素方法學(xué)考察結(jié)果:按照優(yōu)選的色譜條件，以對(duì)照品溶液進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)表1，不同溫度和不同時(shí)間條件下，葛根素含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。以對(duì)照品溶液進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，可得回歸方程為:y=110.87x-7.12，R=1，說(shuō)明葛根素濃度在0.0522 ～0.3132μg 范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈較好的線性關(guān)系。

表1 葛根素對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.K 值的計(jì)算:以不同時(shí)間不同條件下葛根素含量的對(duì)數(shù)lgc 對(duì)時(shí)間t 作圖，得到各溫度下的回歸方程，符合一級(jí)反應(yīng)方程式lgC = -kt/2.303 +lgC0，可確定葛根素含量隨時(shí)間變化符合化學(xué)動(dòng)力學(xué)一級(jí)反應(yīng)。再由回歸方程斜率求出各溫度下藥物降解反應(yīng)速度常數(shù)K 值［3］，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同溫度和不同時(shí)間條件下葛根素含量的測(cè)定結(jié)果［3］

3.反應(yīng)活化能的計(jì)算:根據(jù)各溫度下的KS 值得出lgK，結(jié)果見(jiàn)表3。以lgK 對(duì)1/T 作圖，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:lgK = -4669.6 ×1/T +10.639，r =0.9929。由Arrhenius 指數(shù)定律:lgK = -E/2.303RT+lgA 及直線斜率求出活化能E =89.463kJ/mol，在(41.84 ～125.52)kJ/mol 范圍內(nèi)，說(shuō)明用經(jīng)典恒溫法預(yù)測(cè)室溫下葛根素的穩(wěn)定性有實(shí)際意義。

表3 溫度與速度常數(shù)表

4. 室溫下有效期t0.9的計(jì)算:將回歸方程lgK =-4669.6 ×1/T+10.639(r=0.9929)，外推可得室溫25℃(T =273 +25)時(shí)的K25℃=9.32 ×10-6/h，從而可計(jì)算出在室溫25℃下有效成分減少10%所需的時(shí)間，即有效期t0.9，t0.9=0.1054/K25℃=11309h =1.29a(年)。

討 論

采用經(jīng)典恒溫加速試驗(yàn)法預(yù)測(cè)健腦益智膠囊的有效期，設(shè)置了試驗(yàn)的溫度和時(shí)間，試驗(yàn)過(guò)程中可觀察到，隨著溫度升高，時(shí)間延長(zhǎng)樣品顏色加深，其中100℃下樣品的顏色最深。經(jīng)高效液相層析法測(cè)得的含量隨著溫度升高，時(shí)間延長(zhǎng)，葛根素含量逐漸降低。經(jīng)試驗(yàn)，在密閉條件下，預(yù)測(cè)健腦益智膠囊有效期為1.29 年，有效期時(shí)間偏短。關(guān)于健腦益智膠囊的有效期還有待于結(jié)合長(zhǎng)期留樣觀察法結(jié)果進(jìn)一步進(jìn)行確定。

1 潘平康，張超，吳海琴，等. 葛根素對(duì)大鼠腦缺血后海馬中EPO 和STAT-5 表達(dá)的影響［J］. 卒中與神經(jīng)疾病，2013，20(3):137 -140

2 梅志剛，王明智，劉曉潔，等. 葛根素對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷α7nAChR、NF-κB p65 及STAT3 mRNA 表達(dá)的影響［J］. 中華中醫(yī)藥雜志，2013，28(1):113 -117

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