不同M 受體亞型拮抗劑在改善失血性休克大鼠微循環(huán)障礙中的作用比較

陳穎茜 王文達(dá) 胡莎莎 劉天行 曹濟(jì)民

毒蕈堿受體(muscarinic receptor)(M 受體)按基因分型目前分為M1、M2、M3、M4 和M5 5 種亞型，這些受體亞型不同程度地表達(dá)于外周組織與中樞神經(jīng)系統(tǒng)［1］。M 受體拮抗劑在臨床中的應(yīng)用包括非選擇性M 受體拮抗劑阿托品與山莨菪堿用于抗休克治療［2］。失血性休克時(shí)內(nèi)穩(wěn)態(tài)不能維持，可應(yīng)用大劑量阿托品擴(kuò)血管，其擴(kuò)血管的機(jī)制可能是機(jī)體代償性散熱反應(yīng)，也可能是阿托品阻斷M 受體后的擴(kuò)血管效應(yīng)所致［3，4］。大劑量山莨菪堿對改善感染性休克可能為封閉M 受體、上調(diào)α7nAChR 活性而開啟相關(guān)抗炎通路［5］。也有研究顯示，敲除M3 受體基因的小鼠，乙酰膽堿不能對一些小動(dòng)脈產(chǎn)生擴(kuò)血管作用，或許與血管M 受體直接相關(guān)［6］。盡管以前在不同研究層次上觀察到了拮抗M 受體的改善微循環(huán)效應(yīng)，但究竟是何種M 受體亞型介導(dǎo)這種作用，目前并不十分清楚。因此，有必要對M 受體亞型拮抗劑的抗休克作用進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。本研究在大鼠失血性休克模型上，觀察了M1、M2 和M3 受體拮抗劑對失血性休克大鼠腸系膜微循環(huán)的不同影響，試圖闡明何種M受體亞型對改善微循環(huán)障礙所起的作用最大，為闡明M 受體拮抗劑抗休克的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1.動(dòng)物和試劑:普通級3 ～4 月齡雌性Wistar 大鼠30 只，體重160 ～220g(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號:SCXK -京-2006)。動(dòng)物飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)遵守北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生命倫理委員會(huì)的有關(guān)規(guī)定。替侖西平鹽酸鹽水合物(telenzepine dihydrochloride hydrate)、西貝母堿(imperialine)和4 -二苯乙酰氧-N -甲基哌啶甲碘化物(4 -diphenylacetoxy-N - methylpiperidine methiodide，4 - DAMP)購自Sigma 公司，其他常規(guī)試劑購自北京化學(xué)試劑公司。

2.動(dòng)物分組:根據(jù)Frank 等［7］的方法建立大鼠失血性休克模型。實(shí)驗(yàn)前將大鼠隨機(jī)分為5 組，每組5 只。將每組休克前的數(shù)據(jù)作為自身正常對照。①對照組:動(dòng)脈放血(1.5ml/100g)，不給予藥物治療，僅放血后5min 內(nèi)給予生理鹽水-自體血液混合液體(體積比3∶1)回輸治療;②阿托品治療組:于回輸治療后靜脈推注阿托品，根據(jù)文獻(xiàn)［8］選擇阿托品劑量1250mg/kg;③M1 受體拮抗劑替侖西平治療組:根據(jù)文獻(xiàn)［9］選擇替侖西平劑量0.22mg/kg;④M2 受體拮抗劑西貝母堿治療組:根據(jù)文獻(xiàn)［10］選擇西貝母堿為9.6 ×10-3mg/kg;⑤M3受體拮抗劑4 -DAMP 治療組:根據(jù)文獻(xiàn)［11］選擇4 -DAMP劑量0.22mg/kg。以上M 受體拮抗劑的劑量選擇均是在參考有關(guān)文獻(xiàn)的前提下，再經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)的量-效關(guān)系分析，最終選擇大鼠可耐受的較大劑量。

3. 腸系膜微循環(huán)的觀察:實(shí)驗(yàn)中在微循環(huán)顯微鏡(B230LED，重慶奧特光學(xué)儀器有限公司)高倍鏡下觀察腸系膜上動(dòng)脈以下第3 級分支的微動(dòng)脈，用圖像分析系統(tǒng)(PCLB-1A，北京微信斯達(dá)科技發(fā)展有限公司)觀察微動(dòng)脈血管口徑、血流速度、血液流態(tài)和滲出、出血情況等，并拍攝微血管照片。每組大鼠觀察腸系膜三級微動(dòng)脈25 條(n =25)，進(jìn)行藥效的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。選取觀察微血管時(shí)保證休克前、休克后及治療后所觀察的區(qū)域基本相同。大鼠動(dòng)脈血壓下降至40mmHg 即判定為休克狀態(tài)。每只大鼠休克10min 后進(jìn)行觀察，觀察時(shí)間5min;之后補(bǔ)液及給藥，10min 后再次觀察5min。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。采用組間比較和自身對照的方式進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)組與對照組之間的比較采用t 檢驗(yàn)和方差分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1. 不同M 受體拮抗劑對失血性休克時(shí)微循環(huán)血流狀態(tài)變化的影響:實(shí)驗(yàn)中微循環(huán)血流狀態(tài)的變化見表1。所觀察到的血流狀態(tài)顯示，阿托品和M1 受體拮抗劑替侖西平的改善微循環(huán)作用最明顯，而M2 和M3 受體拮抗劑基本未能顯示改善微循環(huán)的作用。

表1 不同M 受體拮抗劑作用后血流狀態(tài)變化情況

2.不同M 受體拮抗劑對失血性休克時(shí)微循環(huán)血管口徑的影響:由于微循環(huán)狀態(tài)的變化直接與微動(dòng)脈管徑的變化有關(guān)，本研究進(jìn)一步觀察和統(tǒng)計(jì)了不同M受體拮抗劑對休克大鼠微循動(dòng)脈口徑的變化。與休克前相比，休克后腸系膜微動(dòng)脈出現(xiàn)典型的收縮狀態(tài)(圖1)。單純生理鹽水-自體血液回輸后微動(dòng)脈管徑進(jìn)一步減小，休克進(jìn)一步發(fā)展。但由于補(bǔ)液是失血性休克的對癥治療方案，故藥物治療均需以補(bǔ)充足量體液為前提。

圖1 大鼠休克前、休克后及給予M1 受體拮抗劑后腸系膜微循動(dòng)脈口徑變化的代表性顯微照片

應(yīng)用阿托品及替侖西平治療后，相比于休克狀態(tài)時(shí)，大鼠口唇顏色稍變紅潤。應(yīng)用西北母堿治療后口唇顏色變化不明顯。應(yīng)用4 -DAMP 后，大鼠生理狀況迅速惡化，皮膚黏膜迅速變紫，心搏變得微弱，大部分動(dòng)物均在進(jìn)行微循環(huán)測量前死亡，微動(dòng)脈管徑迅速變小，甚至由于放大倍數(shù)不足而難以測量其數(shù)據(jù)，僅有少數(shù)在死亡前測得微動(dòng)脈管徑數(shù)據(jù)。各組休克前、休克后及治療后的微動(dòng)脈平均直徑見表2。由于不同微血管的口徑可能有所不同，盡管表2 給出了微動(dòng)脈(n=25)平均直徑的變化，但仍可能存在抽樣不足帶來的偏差。為了使各組數(shù)據(jù)更具可比性，本研究以每組動(dòng)物休克前的微動(dòng)脈直徑作為參照(1 或100%)，再將各組動(dòng)物休克后及治療后微動(dòng)脈直徑變化的百分率進(jìn)行了比較(圖2)。結(jié)果表明，失血性休克后腸系膜三級微動(dòng)脈直徑的變化百分率明顯增大，提示微動(dòng)脈收縮。阿托品及M1 受體拮抗劑替侖西平治療后呈現(xiàn)微動(dòng)脈明顯舒張，與休克前的微動(dòng)脈直徑相比，百分率變化減小。M2 受體拮抗劑西貝母堿和M3 受體拮抗劑4 -DAMP 則均不能改善微動(dòng)脈的收縮(圖2)。

表2 各組休克前、休克后及治療后腸系膜微動(dòng)脈平均直徑的變化(μm，每組微動(dòng)脈n=25)

圖2 休克前后及治療后大鼠腸系膜微動(dòng)脈直徑的百分率變化(每組n=25)

討 論

本研究通過腸系膜微循環(huán)觀察直接證明了臨床上補(bǔ)充足量體液后給予大量阿托品治療休克的有效性，并顯示經(jīng)M1 受體拮抗劑治療后休克大鼠微循環(huán)障礙的情況有明顯改善，而M2 及M3 受體拮抗劑則沒有改善休克微循環(huán)障礙的作用，休克進(jìn)一步發(fā)展［12］。由于本研究為全身用藥，考慮到M1 受體分布于胃壁細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，從全身作用來看，替侖西平可能作用于神經(jīng)節(jié)的M1 受體，對交感神經(jīng)產(chǎn)生了抑制作用，減少了兒茶酚胺的釋放，緩解了微動(dòng)脈的收縮［13］。另一種可能是，腸系膜微循環(huán)表達(dá)M1 受體，替侖西平可通過拮抗腸系膜微循環(huán)M1 受體，使微循環(huán)血管擴(kuò)張，進(jìn)而改善休克時(shí)的微循環(huán)障礙。

現(xiàn)有研究表明，M2 受體主要分布于心臟、腦和自主神經(jīng)節(jié)，激動(dòng)后引起心臟收縮力和心率降低。若M2 受體在腸系膜微循環(huán)上也起著類似激動(dòng)副交感神經(jīng)的作用，則M2 受體拮抗劑作用后會(huì)導(dǎo)致內(nèi)臟血管的收縮，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。M3 受體分布于外分泌腺、平滑肌、血管內(nèi)皮、腦和自主神經(jīng)節(jié)，激動(dòng)后引起平滑肌松弛和腺體分泌［12］。本研究結(jié)果提示腸系膜微循環(huán)上可能存在M3 受體，M3 受體拮抗劑可阻斷M3 受體對平滑肌的松弛作用，導(dǎo)致微動(dòng)脈迅速收縮，從而使休克進(jìn)一步發(fā)展。

整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)雖能較好地模擬臨床治療過程，但也僅能從全身作用了解各M 受體亞型拮抗劑在抗休克治療作用中的權(quán)重，全身給予M 受體拮抗劑治療休克可能存在多個(gè)靶點(diǎn)。在隨后的研究中可通過局部血管內(nèi)給藥精確地確定微循環(huán)M 受體亞型的分布和功能。

總之，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了大劑量非選擇性M受體拮抗劑(以阿托品為代表)治療休克時(shí)起主要作用的M 受體亞型，并發(fā)現(xiàn)了各M 受體拮抗劑各自的全身綜合效應(yīng)，可為臨床針對性用藥提供參考。若在臨床上能夠選用對M1 受體選擇性更強(qiáng)的M 受體拮抗劑，則其正向治療作用不會(huì)受到M2、M3受體的負(fù)向作用干擾，可更有效地治療休克，并減少由于多種作用位點(diǎn)帶來的不良反應(yīng)。本研究為揭示M受體拮抗劑抗休克的機(jī)制提供了一定的整體實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對于開發(fā)選擇性更高的M 受體亞型拮抗劑有一定啟示意義。

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