天目山野生春蘭根中可培養(yǎng)內(nèi)生細菌多樣性研究

武永秀 宋彤彤 張瑞英 劉亮 邵紅 李潞濱 孫磊

（1.河北大學生命科學學院 河北省微生物多樣性研究與應用實驗室，保定 071002；2.中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所，北京 100091；3.浙江天目山國家級自然保護區(qū)管理局，臨安 311311）

植物內(nèi)生細菌是植物微生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，具有多種有益的生物學功能，已成為植物微生物學科具有挑戰(zhàn)性的研究領域。植物內(nèi)生細菌是指生活在植物組織內(nèi)部，沒有給植物造成實質(zhì)性損害，或者除了定居還從中獲益的細菌［1］。內(nèi)生細菌可以定殖在根、莖、葉、花、果實、種子等不同器官［2，3］。許多內(nèi)生細菌在離體條件下都可表現(xiàn)出對植物有益的特性，但是只有少數(shù)細菌被證實可高效促進植物生長，或在農(nóng)業(yè)條件下具有生防作用［4，5］。因此加深對植物內(nèi)生細菌的研究，闡明它們的作用，必可促進其在可持續(xù)農(nóng)業(yè)中的應用。

春蘭（Cymbidium goeringii Rchb. f.）為多年生地生型草本植物，屬于蘭科蘭屬，是中國蘭花的代表之一，主要分布于陜西、甘肅、河南至華東、華南和西南各省區(qū)，以江蘇、浙江所產(chǎn)春蘭為貴。目前，對春蘭植物內(nèi)生細菌的研究報道較少，本實驗室曾以溫室栽培春蘭為材料，對其內(nèi)生細菌分離條件及根內(nèi)可分泌IAA、鐵載體的細菌多樣性進行研究［6-8］。本研究通過對采自浙江天目山的野生春蘭根內(nèi)可培養(yǎng)細菌多樣性的研究，以期豐富植物內(nèi)生細菌資源，并為植物-微生物相互作用關系研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

于2009 年3 月自浙江省天目山共采集5 株健康春蘭，空運回實驗室后立即進行內(nèi)生細菌分離。

1.2 方法

1.2.1 野生春蘭根內(nèi)生細菌的分離 5 株健康春蘭每株取根1 g，無菌水沖洗根表面土壤，混合樣品后用于內(nèi)生細菌的分離。首先對根進行表面滅菌，表面滅菌條件參照劉琳等［7］方法：75%乙醇浸泡3 min，3%次氯酸鈉溶液處理2 min，75%乙醇浸泡30 s，最后用無菌水沖洗。取最后一次沖洗水涂布于R2A 平板并將處理后的根組織于R2A 平板上輕壓涂抹，28℃暗培養(yǎng)6 d，無菌落生成則表示表面滅菌合格。將表面滅菌合格的根置于無菌研缽中，加入無菌生理鹽水及少量的無菌石英砂研磨，研磨液梯度稀釋后涂布R2A 培養(yǎng)基（Difco）和TSA 培養(yǎng)基（Difco）平板，各設3 個平行，28℃。挑取適當稀釋度平板上的所有菌落，純化后4℃保藏備用。

1.2.2 根內(nèi)生細菌的16S rDNA 序列擴增 菌落裂解法［9］制備反應模板。采用細菌16S rDNA 通用引物［10］27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'（上海英駿生物技術(shù)有限責任公司合成）進行擴增。PCR 反應程序：94℃預變性4 min；94℃變性45 s，54℃退火45 s，72℃延伸45 s，30 個循環(huán)；72℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴增產(chǎn)物。

1.2.3 根內(nèi)生細菌的16S rDNA 序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析 對所有菌株進行16S rDNA 序列測定。測序結(jié)果利用BLAST 軟件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi）與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對分析，選取同源性最高的且有效發(fā)表的菌株序列，利用MEGA5.1 軟件（http：//www.megasoftware.net/mega5.1.html）進行分析，用Clustal W 按照最大同源性的原則進行排序，采用Kimura-2 計算核苷酸差異值，最后用鄰接法（Neighbor-Joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［11］。

1.2.4 多樣性指數(shù)計算 根據(jù)序列比對結(jié)果計算不同培養(yǎng)基獲得的香濃-威納多樣性指數(shù)（Shannon-Weaver index，H）。計算公式為：H=-PilnPi，式中，Pi 為第i 種細菌占該細菌總數(shù)的比率。

2 結(jié)果

2.1 野生春蘭根內(nèi)生細菌的種群數(shù)量

將采集的野生春蘭根樣品表面滅菌后進行內(nèi)生細菌的分離培養(yǎng)，同時檢測表面滅菌效果。5 d 后檢測平板無菌落形成，證明表面滅菌徹底，分離結(jié)果可用。根據(jù)菌落形態(tài)進行分類、編號、純化，最終從野生春蘭根中得到內(nèi)生細菌63 株，其中R2A 培養(yǎng)基中得到56 株，TSA 培養(yǎng)基中得到7 株。R2A培養(yǎng)基獲得的內(nèi)生細菌種群數(shù)量為4×104cfu/g fw，TSA 培養(yǎng)基獲得的細菌種群數(shù)量為0.5×104cfu/g fw。

2.2 野生春蘭根內(nèi)生細菌的多樣性分析

測定63 株春蘭內(nèi)生細菌的16S rDNA 序列，將測定的序列登錄GenBank，登錄號為：KF751813-KF751823。將測序結(jié)果與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對分析，序列分析結(jié)果（表1）表明，63 株內(nèi)生細菌分屬于變形菌門的β-變形菌綱（31.74%）、γ-變形菌綱（7.94%）以及厚壁菌門（60.32%）的6 個屬的8 個種，其中芽孢桿菌屬為最優(yōu)勢菌屬（50.79%）。分離自R2A 培養(yǎng)基的56 株內(nèi)生細菌分屬于伯克氏菌屬（Burkholderia）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、Dyella 菌屬、芽孢桿菌屬（Bacillus）和Lysinibacillus 屬。31 株細菌屬于芽孢桿菌屬，為最優(yōu)勢菌屬，占R2A 培養(yǎng)基分離總菌數(shù)的55.36%；20 株細菌屬于伯克氏菌屬，為次優(yōu)勢菌屬，占分離總菌數(shù)的35.71%。分離自TSA 培養(yǎng)基的7 株細菌分屬于假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、Lysinibacillus 屬及類芽孢桿菌屬（Paenibacillus），假單胞菌屬的細菌占TSA 培養(yǎng)基分離總菌數(shù)的42.86%。由比對結(jié)果構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。計算結(jié)果顯示，天目山野生春蘭根內(nèi)生細菌香濃-威納多樣性指數(shù)為1.56，而R2A 培養(yǎng)基及TSA 培養(yǎng)基獲得的天目山野生春蘭根內(nèi)生細菌多樣性指數(shù)分別為1.36 和1.28。

表1 天目山野生春蘭根內(nèi)生細菌16S rDNA 序列相似性分析

圖1 天目山野生春蘭可培養(yǎng)內(nèi)生細菌的16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

本研究分離出的野生春蘭根內(nèi)生細菌的優(yōu)勢菌屬為芽孢桿菌屬（58.7%）和伯克氏菌屬（31.7%）。該兩個屬的細菌作為有益植物內(nèi)生細菌研究較多，報道顯示伯克氏菌屬具有固氮功能［12］，ACC 脫氨基酶活性［13］，可分泌IAA、鐵載體［6，7］及生物防治［14］等多種生物學活性。芽孢桿菌屬細菌作為常見的可培養(yǎng)的植物內(nèi)生細菌對一些植物病害有較好的防治效果，并且對植物的生長具有促生作用［15］。我們從天目山野生春蘭根內(nèi)也分離到了1 株與Dyella 屬細菌16S rDNA 相似性很高的菌株，目前Dyella 屬有8 個已知種，均分離自土壤，作為植物內(nèi)生細菌僅見劉琳等［7］從溫室盆栽春蘭根內(nèi)分離出一株可分泌IAA 的Dyella sp.，這在一定程度上證明植物基因型對內(nèi)生細菌具有選擇性。

自報道可從表面滅菌的植物當中分離獲得細菌［16，17］開始，到現(xiàn)在通過培養(yǎng)方法和非培養(yǎng)方法已發(fā)現(xiàn)了200 個屬的細菌可作為植物內(nèi)生細菌存在。研究和報道最多是變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）的細菌。本研究從天目山野生春蘭根內(nèi)只分離到了變形菌門和厚壁菌門的細菌，且僅歸屬于6 個屬的8個種。本實驗室從溫室盆栽春蘭根中分離到的可分泌IAA的細菌屬于18個已知屬和兩個潛在的新屬［7］，分泌鐵載體的細菌屬于17 個已知屬［6］。可見溫室盆栽春蘭根內(nèi)生細菌多樣性遠遠高于浙江天目山的野生春蘭。這可能是由于野生春蘭生長過程中自然條件多變，造成內(nèi)生細菌的生存環(huán)境多變不穩(wěn)定；取樣時間為3 月份，植物剛剛越冬進入生長時期，也可能是造成細菌多樣性較低的另一原因。比較兩種培養(yǎng)基分離的結(jié)果發(fā)現(xiàn)不論是從種群數(shù)量還是多樣性，R2A 培養(yǎng)基獲得數(shù)據(jù)均高于TSA 培養(yǎng)基，R2A培養(yǎng)基更適用于野生春蘭內(nèi)生細菌的分離。本研究結(jié)果表明初春季節(jié)天目山野生春蘭根內(nèi)生可培養(yǎng)細菌多樣性較低。本研究豐富了植物內(nèi)生細菌資源庫，對新物種資源的發(fā)現(xiàn)起到了重要的作用，為有益內(nèi)生細菌的綜合利用提供了科學依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究獲得的天目山野生春蘭根內(nèi)生細菌分屬于變形菌門和厚壁菌門的6 個屬的8 個種，其中芽孢桿菌屬（Bacillus）為最優(yōu)勢菌屬，其余菌分屬于伯克氏菌屬（Burkholderia）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、Dyella 菌 屬、Lysinibacillus 屬 和 類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）。

［1］ Kado CI. Plant pathogenic bacteria［M］//Balows A, Truper HG, Dworkin M, et al. The prokaryotes. New York：Springer-Verlag, 1991：659-674.

［2］ Compant S, Clément C, Sessitsch A. Plant growth-promoting bacteria in the rhizo- and endosphere of plants：There role, colonization, mechanisms involved and prospects for utilization［J］. Soil Biology and Biochemistry, 2010（42）：669-678.

［3］ Fürnkranz M, Lukesch B, Müller H, et al. Microbial diversity inside pumpkins：microhabitat-specific communities display a high antagonistic potential against phytopathogens［J］. Microb Ecol Doi：10.1007/s00248-011-9942-4.

［4］ Berg G. Plant-microbe interactions promoting plant growth and health：perspectives for controlled use of microorganisms in agriculture［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2009, 84：11-18.

［5］ Scherwinski K, Grosch R, Berg G. Effect of bacterial antagonists on lettuce：active biocontrol of Rhizoctonia solani and negligible. short-term effect on non-target microbes［J］. FEMS Microbiology Ecology, 2008, 64：106-116.

［6］ 孫磊, 邵紅, 劉琳, 等.可產(chǎn)生鐵載體的春蘭根內(nèi)生細菌多樣性［J］.微生物學報, 2011, 51（2）：189-195.

［7］ 劉琳, 孫磊, 張瑞英, 等.春蘭根中可分泌吲哚乙酸的內(nèi)生細菌多樣性［J］.生物多樣性, 2010, 18（2）：182-187.

［8］ 孫磊, 畢曉寶, 李潞濱, 等.春蘭根內(nèi)生細菌分離培養(yǎng)方法的初步研究［J］.河北農(nóng)業(yè)大學學報, 2009, 32（1）：42-46.

［9］ 徐麗, 蔡俊鵬.菌落PCR 方法的建立及其與常規(guī)PCR 方法的比較［J］.華南理工大學學報：自然科學版, 2004, 32：51-55.

［10］ Lane DJ. 16S/23S rRNA sequencing［M］//Stackebrandt E, Goodfellow M. Nucleic acid techniques in bacterial systematics. United Kingdom：John Wiley & Sons, Chichester, 1991：115-175.

［11］ Tamura K, Peterson D, Peterson N, et al. MEGA5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods［J］. Molecular Biology and Evolution, 2011, 28（10）：2731-2739.

［12］ James EK. Nitrogen fixation in endophytic and associative symbiosis［J］. Field Crops Research, 2000, 65（2-3）：197-209.

［13］ Sun Y, Cheng Z, Glick BR. The presence of a 1-aminnocyclopropane-1-carboxylate（ACC）deaminase deletion mutation alters the physiology of the endophytic plant growth-promoting bacterium Burkholderia phytofirmans PsJN［J］. FEMA Microbiol Lett, 2009, 296（1）：131-136.

［14］ Fishal EM, Meon S, Yun WM. Induction of tolerance to fusarium wilt and defense-related mechanisms in the plantlets of susceptible Berangan Banana pre-noculated with Pseudomonas sp.（UPMP3）and Burkholderia sp.（UPMB3）［J］. Agricul Sci China, 2010, 9（8）：1140-1149.

［15］ Liu B, Qiao H, Huang L, et al. Biological control of take-all in wheat by endophytic Bacillus subtilis E1R-j and potential mode of action［J］. Biological Control, 2009, 49（3）：277-285.

［16］ Samish Z, Dimant D. Bacterial population in fresh, healthy cucumbers［J］. Food Manufacture, 1959, 34：17-20.

［17］ Mundt JO, Hinkle NF. Bacteria within ovules and seeds［J］. Appl Environ Microbiol, 1976, 32（5）：694-698.