一株篩選自高寒草地木聚糖酶產(chǎn)生真菌的鑒定及酶學(xué)特性研究

蘆光新 陳秀蓉 王軍邦 吳楚

（1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，蘭州 730070；3.中國(guó)科學(xué)院地理科學(xué)與資源研究所，北京 100094；4.長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院，荊州 434025）

半纖維素是自然界中含量?jī)H次于纖維素的第二豐富的多聚糖［1］。木聚糖是一種由 β-1，4-木糖苷鍵連接形成并帶有多種取代基的多聚糖，結(jié)構(gòu)中含有許多葡萄糖醛酸、乙?；⒗?、阿魏酸、香豆酸等側(cè)鏈基團(tuán)，是植物細(xì)胞壁半纖維素的主要成分［2］，其完全降解需要多種酶的協(xié)同作用［3］。木聚糖 酶（endo-1，4-β-D-xylanohydrolase，EC3.2.1.8）以內(nèi)切方式作用于木聚糖主鏈，產(chǎn)生不同鏈長(zhǎng)的寡糖及少量的木糖，是一類(lèi)能特異降解木聚糖的酶類(lèi)，對(duì)半纖維素降解起著關(guān)鍵作用［3］，在自然界各種微生物、植物、動(dòng)物瘤胃等環(huán)境均有分布［4，5］。木聚糖酶大多為單亞基蛋白，分子質(zhì)量 8-145 kD，根據(jù)催化域氨基酸序列及結(jié)構(gòu)的相似性，木聚糖酶多被劃分為糖苷水解酶第10 家族或第 11 家族，另外，第5 家族、第7 家族、第8 家族或第43 家族的木聚糖酶也有報(bào)道［6］。不同來(lái)源的酶，氨基酸組成差異較大，酶學(xué)性質(zhì)也有所不同，酶的最適反應(yīng) pH 值多為偏酸性，最適反應(yīng)溫度 40-75℃［7］，木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)決定了其在應(yīng)用上的潛力及應(yīng)用領(lǐng)域。木聚糖酶的工業(yè)化應(yīng)用始于20 世紀(jì)80 年代，可用作紙漿和造紙工業(yè)中的生物漂白劑［8，9］、食品工業(yè)的改良劑［10］等，還可用來(lái)制備低聚木糖［11］。隨著生物技術(shù)在工業(yè)中的發(fā)展，在食品加工、飼料生產(chǎn)、制漿造紙、能源工業(yè)等行業(yè)對(duì)木聚糖酶的需求越來(lái)越多［12，13］。無(wú)論其經(jīng)濟(jì)價(jià)值還是應(yīng)用前景，對(duì)產(chǎn)木聚糖酶的資源的研究尤為重要。

在我國(guó)北方大部分農(nóng)牧區(qū)，農(nóng)作物秸稈的利用主要以燃料為主［14］，也有部分經(jīng)粉碎后用于飼料。但由于農(nóng)作物秸桿細(xì)胞壁的結(jié)晶度較高，木質(zhì)素、纖維素和半纖維素之間鑲嵌形成堅(jiān)固的酯鍵結(jié)構(gòu)［15］和富含戊聚糖［16］，降低了動(dòng)物的采食率，同時(shí)也影響動(dòng)物對(duì)脂肪和蛋白質(zhì)的消化和吸收［17］，這些因素均限制了農(nóng)作物秸稈在飼料資源化方面的利用。研究發(fā)現(xiàn)，木聚糖酶可以作為飼料工業(yè)的添加劑［18］，能夠改善農(nóng)作物飼料的性能，降解可溶性多糖，降低黏度，提高動(dòng)物內(nèi)源性消化酶活性的發(fā)揮，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收率［19］。因此，篩選產(chǎn)木聚糖酶的微生物資源，選育優(yōu)良產(chǎn)酶菌株進(jìn)行農(nóng)作物秸稈的處理，無(wú)疑對(duì)提高農(nóng)作物秸稈的利用效率提供了一個(gè)新的思路，并且對(duì)促進(jìn)循環(huán)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)具有重大意義。

目前在農(nóng)作物秸稈飼料化資源利用方面的研究較多，有學(xué)者也提出采用物理化學(xué)和生物處理相結(jié)合的方法，但由于生物處理過(guò)程中采用的菌株對(duì)產(chǎn)木聚糖酶的量、酶活性、營(yíng)養(yǎng)條件、溫度以及pH環(huán)境的要求較為苛刻，處理效果并不理想。盡管?chē)?guó)內(nèi)外對(duì)產(chǎn)生木聚糖酶的微生物資源方面做了大量的研究工作，但由于在工業(yè)化利用過(guò)程中，對(duì)木聚糖酶的活性及反應(yīng)條件要求不同，目前得到的產(chǎn)木聚糖酶的菌種資源無(wú)法滿足市場(chǎng)需求。從自然環(huán)境中分離篩選產(chǎn)木聚糖酶的微生物資源，仍然是相關(guān)學(xué)者努力突破的方向。為此，從提高秸稈飼料利用率的角度出發(fā)，以本課題組前期從高寒草地土壤中篩選出具有降解纖維素功能且能夠高效產(chǎn)木聚糖酶活性的菌株為研究對(duì)象，對(duì)其分類(lèi)地位進(jìn)行鑒定，并對(duì)其液體培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)酵粗酶液的酶學(xué)性質(zhì)和主要生物學(xué)特性進(jìn)行研究，旨在探索其在農(nóng)作物秸稈飼料化利用的可行性和應(yīng)用價(jià)值，為尋找高效降解農(nóng)作物秸稈的菌種資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 由本課題組從東祁連山高寒草地土壤中分離獲得，具有分解纖維素物質(zhì)的能力，菌株編號(hào)為24d。

1.1.2 培養(yǎng)基［20］馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA），用于供試菌株的轉(zhuǎn)接和活化。馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基（PS），用于供試菌株菌絲的培養(yǎng)。察氏培養(yǎng)基，用于供試菌株在不同溫度條件下生長(zhǎng)速度的測(cè)定。

供試碳、氮源培養(yǎng)基：在察氏培養(yǎng)基中，分別按培養(yǎng)基總體積的1%配置不同碳源培養(yǎng)基，5 種碳源分別為糊精、可溶性淀粉、麥芽糖、葡萄糖和蔗糖；分別按培養(yǎng)基總體積的0.25%配置不同氮源培養(yǎng)基，5 種氮源分別為蛋白胨、尿素、硫酸銨、磷酸胺和硝酸鈉。pH 調(diào)至6.0-7.0，每組設(shè)3 個(gè)重復(fù)，用于研究供試菌株對(duì)不同碳、氮源的利用程度。

液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基［21］：NaNO32.5 g，KH2PO41.0 g，CaCl2·6H2O 0.1 g，MgSO40.3 g，NaCl 0.1 g，F(xiàn)eCl30.01 g，秸稈（粉）0.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 用稀鹽酸調(diào)制6.0-7.0，用于測(cè)定供試菌株產(chǎn)木聚糖酶的酶活力。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化 將保存的供試菌種接種于PDA 平板培養(yǎng)基，25℃恒溫培養(yǎng)7-8 d 后，連續(xù)轉(zhuǎn)接2-3 次，純化、復(fù)壯。

1.2.2 菌株鑒定 經(jīng)活化、純化的菌株挑取少量菌絲接種于PS 液體培養(yǎng)基中，于25℃，150 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)，過(guò)濾后收集菌絲體，采用試劑盒法提取基因組DNA。以基因組DNA 為模板，利用一對(duì)rDNA-ITS 通用引物（ITS-1、ITS-4）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，送樣測(cè)定DNA 序列。將測(cè)序獲得的ITS 序列通過(guò)與GenBank 中的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)序列進(jìn)行Blastn 分析，采用CLUSTAL 軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)［22］，并用MEGA 4.0 軟件采用Neighbor-Joining 法 和UPGMA 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)［23，24］。ITS-1：5'-GTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS-4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。PCR 反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性1 min，50℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。基因組DNA 提取試劑盒（SK1375）、引物合成、序列測(cè)定均由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2.3 生物學(xué)特性 參照Li 等［25］、曹春蕾等［26］的方法，在PDA 平板上將培養(yǎng)7-10 d 的供試菌株用直徑6 mm 的打孔器切取菌餅，分別轉(zhuǎn)接于測(cè)定不同內(nèi)容的培養(yǎng)基中，25℃黑暗條件下培養(yǎng)（除溫度處理試驗(yàn)），3 次重復(fù)，用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，以第7 天測(cè)定的菌落直徑作為評(píng)定菌株生長(zhǎng)速率的依據(jù)。溫度對(duì)真菌生長(zhǎng)的影響：分別于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃和40℃等6 個(gè)溫度培養(yǎng)。碳、氮源對(duì)真菌生長(zhǎng)的影響：分別轉(zhuǎn)接于含1%的不同碳源和0.25%的不同氮源培養(yǎng)基上培養(yǎng)。試驗(yàn)結(jié)束后測(cè)定供試菌株的菌落直徑。

1.2.4 供試菌株產(chǎn)木聚糖酶特性的研究

1.2.4.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 參照陸文清等［27］的方法，以吸光值（OD540）作橫坐標(biāo)，分別以對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)木糖溶液含糖的毫克數(shù)為縱坐標(biāo)，列出直線回歸方程，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。

圖1 以木糖為底物的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.4.2 粗酶液的制備 將活化的菌株分別接種于以0.5 g 油菜秸稈粉為底物，盛有50 mL 液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基150 mL 的錐形瓶中，以不接菌為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3 次。在25℃ 150 r/min 條件下，置于搖床震蕩培養(yǎng)，試驗(yàn)周期為7 d。試驗(yàn)結(jié)束后，經(jīng)尼龍絲網(wǎng)過(guò)濾的發(fā)酵液，用滅菌的1 mL 移液器槍頭，吸取2 mL 上清液，于4℃ 10 000 r/min，離心10 min，取上清液制備粗酶液。

1.2.4.3 木聚糖酶活力測(cè)定 木聚糖酶活力測(cè)定方法參照文獻(xiàn)［28］，稍有改進(jìn)。吸取液體搖瓶發(fā)酵粗酶液0.2 mL，以1 mL 含0.5%的樺木木聚糖為反應(yīng)底物的檸檬酸緩沖液（pH 5.5，終濃度為0.1 mol/L）組成反應(yīng)體系，在37℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min，采用DNS 法（3，5-二硝基水楊酸）測(cè)定最終反應(yīng)產(chǎn)物在540 nm 波長(zhǎng)下的吸光值［29］，空白對(duì)照用等體積熱變性的粗酶液代替新鮮的粗酶液。酶活力的計(jì)算方法參照國(guó)際理論應(yīng)用化學(xué)協(xié)會(huì)（IUPAC）推薦的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)方法，分別以每毫升粗酶液每分鐘產(chǎn)生1 μmol 木糖為一個(gè)國(guó)際單位，計(jì)IU/mL［30］。

1.2.4.4 木聚糖酶的最適溫度、pH 值以及對(duì)pH值的穩(wěn)定性 按照上述酶活力測(cè)定的方法，分別在4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃和70℃下測(cè)木聚糖酶活力，以溫度（T）為橫坐標(biāo)，相對(duì)木聚糖酶活力為縱坐標(biāo)作圖（以酶活最高者為100%）。按同樣的方法，以酶活力最大時(shí)的反應(yīng)溫度為酶催化活性最適溫度，分別在pH2.0-10.0 條件下測(cè)木聚糖酶活力，以pH 為橫坐標(biāo)，相對(duì)木聚糖酶活力為縱坐標(biāo)作圖（以酶活最高者為100%）。以酶活力最大時(shí)的pH 值為酶催化活性最適pH。另外，將粗酶液在25℃條件下放置24 h 后，在不同pH 值條件下測(cè)定剩余酶活力，測(cè)定粗酶液對(duì)不同pH 環(huán)境的穩(wěn)定性。1.2.5 數(shù)據(jù)處理及分析 所有數(shù)據(jù)均用Microsoft Excel 錄入并作圖，采用DPS 6.55 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析［31］。

2 結(jié)果

2.1 分子鑒定結(jié)果

以提取的供試菌株的基因組DNA 為模板、ITS-1-ITS-4 為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增片段在500-750 bp 之間（圖2）。測(cè)序結(jié)果在GenBank 中進(jìn)行BLAST 同源性比較，采用Neighbor-Joining 法和UPGMA 法分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果（圖3）顯示，供試菌株24d 與登錄號(hào)AF455415、FJ914710、AJ972795 及UD4203 的同源性達(dá)100%，其中與菌株UD4203 的親緣關(guān)系最近。UD4203 為Saccharicola bicolor，因此，供試菌株24 d初步確定為（Saccharicola bicolor）。

2.2 溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

溫度是影響微生物生長(zhǎng)及其產(chǎn)酶的重要因素。由圖4 可以看出，溫度對(duì)供試菌株的生長(zhǎng)速度的影響較為明顯，在15-40℃溫度范圍內(nèi)能夠生長(zhǎng)，超過(guò)此范圍的上限（40℃），不能生長(zhǎng)。從供試菌株的生長(zhǎng)速度隨溫度變化的曲線來(lái)看，在15-35℃范圍內(nèi)，菌落直徑隨溫度升高而逐漸增大，在35-40℃范圍內(nèi)，菌落直徑隨溫度升高而變小，在30℃的生長(zhǎng)速度高于40℃條件下的生長(zhǎng)速度，其最適生長(zhǎng)溫度為35℃。

2.3 菌絲對(duì)多種碳源、氮源的利用情況

圖4 溫度對(duì)供試菌株生長(zhǎng)的影響

碳、氮源是真菌維持生長(zhǎng)的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，它不僅可以提供能量來(lái)源，而且還可提供合成碳水化合物和氨基酸的原料，同時(shí)也是誘導(dǎo)真菌產(chǎn)酶的重要的物質(zhì)。由表1 可以看出，供試菌株在糊精、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、可溶性淀粉等5 種供試碳源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d 后，菌落直徑大小不盡相同，菌株在不同碳源的培養(yǎng)基上，表現(xiàn)出不同的生長(zhǎng)速度。供試菌株對(duì)5 種碳源的利用表現(xiàn)為：麥芽糖＞淀粉＞蔗糖＞糊精＞葡萄糖。供試菌株在蛋白質(zhì)、尿素、硫酸胺、磷酸胺、硝酸鈉等5 種供試氮源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d 后，菌落直徑大小不盡相同，菌株在不同氮源培養(yǎng)基上，表現(xiàn)出不同的生長(zhǎng)速度。供試菌株對(duì)5 種氮源的利用表現(xiàn)為：蛋白質(zhì)＞磷酸胺＞硫酸胺＞硝酸鈉＞尿素。試驗(yàn)結(jié)果表明，供試菌株在5 種碳、氮源培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng)，說(shuō)明供試菌能夠利用的碳、氮源較廣，不僅能利用單糖、低聚糖等速效碳源，而且還能利用淀粉、糊精等長(zhǎng)效碳源，同時(shí)可以利用無(wú)機(jī)氮源，也能利用有機(jī)氮源。數(shù)據(jù)為x-±s（n=3）；字母表示列比較；不同字母表示差異顯著（P<0.05）

表1 不同碳、氮源對(duì)菌落生長(zhǎng)速度的影響

2.4 供試菌株產(chǎn)木聚糖酶的酶活力及對(duì)溫度和pH值的穩(wěn)定性

產(chǎn)木聚糖酶菌株24d 在不同溫度下的酶活力試驗(yàn)（圖5）表明，在40-60℃下有較高的催化活性，55℃時(shí)酶的催化活性達(dá)到最大值，超過(guò)55℃，相對(duì)酶活力下降非常明顯。供試菌株產(chǎn)木聚糖酶的活性隨溫度的影響變化較大，供試菌株在溫度相對(duì)低的條件下，其產(chǎn)生的木聚糖酶的相對(duì)酶活力較高。圖6 顯示，菌株24d 在pH4-8.5 范圍內(nèi)，酶的催化活性較高，酶反應(yīng)最適pH 值為5.0，在pH3.0-9.5 范圍內(nèi)酶活較穩(wěn)定，供試菌株產(chǎn)生的木聚糖酶有一定的耐堿性。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)自然界中多種微生物均能夠產(chǎn)生木聚糖酶，但不同來(lái)源的木聚糖酶的性質(zhì)和功能具有異質(zhì)性。從微生物木聚糖酶的最適作用pH 來(lái)劃分，木聚糖酶可以分為3 類(lèi)：（1）酸性木聚糖酶；（2）中性木聚糖酶；（3）堿性木聚糖酶。在 1973 年，Horikoshi 等［32］首次報(bào)道了產(chǎn)自細(xì)菌的木聚糖酶，從堿性細(xì)菌 Bacillus sp. No. C-59-2 中純化出最適pH 為 6.0-8.0 的木聚糖酶。此后，研究得到很多堿性木聚糖酶，這其中大多屬于芽孢桿菌屬中分離得到的第10 和第11 家族的堿性木聚糖酶［33，34］。近年來(lái)細(xì)菌產(chǎn)木聚糖酶的研究取得了較大進(jìn)展，獲得了一些不同細(xì)菌來(lái)源的產(chǎn)耐堿性木聚糖酶菌株，但細(xì)菌來(lái)源耐堿性木聚糖酶不易分離和純化，且穩(wěn)定性較差，這些因素客觀上制約了人們對(duì)細(xì)菌堿性木聚糖酶本質(zhì)的認(rèn)識(shí)，延緩了對(duì)這類(lèi)酶的開(kāi)發(fā)和利用［35］。相對(duì)于細(xì)菌產(chǎn)酶而言，真菌分泌的木質(zhì)纖維素酶的酶系比較齊全，且大多數(shù)是胞外酶，其分離純化相較于胞內(nèi)酶而言稍顯容易，且胞外酶性質(zhì)穩(wěn)定，但真菌所產(chǎn)生的木聚糖酶一般為酸性，最適 pH 多在 pH3.0-5.0［12］。目前報(bào)道較多的產(chǎn)木聚糖酶的真菌主要有曲霉屬（Aspergillus）、木霉屬（Trichoderma）、青霉屬（Penicillium）、殼霉屬（Chaetomium）和鐮刀菌屬（Fusarium）等［36］。工業(yè)化的木聚糖酶菌株多集中于曲霉屬和木霉屬，除此之外，研究發(fā)現(xiàn)，青霉屬和鐮刀菌屬的木聚糖酶在具有極高纖維素酶的情況下也具有較高的木聚糖酶活力。上述有關(guān)真菌產(chǎn)木聚糖酶的研究多集中于酸性木聚糖酶［37，38］。

Taneja 等［39］篩選到一株嗜堿真菌Aspergillus nidulans KK299，并部分純化了其所產(chǎn)的木聚糖酶，最適pH 為 8.0，在 pH4.0-9.5 之間穩(wěn)定，這是最早報(bào)道的在堿性條件下有高活性的真菌來(lái)源的木聚糖酶。王坤等［40］從造紙廢水中分離得到的耐堿真菌 Pseudallescheria sp. JSM-2，利用同源克隆和TAIL-PCR 的方法，獲得了一個(gè)堿性木聚糖酶基因 xyl11-1。在畢赤酵母GS115 中重組表達(dá)后的酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，重組XYL11-1 的最適 pH 為6.5，在 pH4.5-9.0 范圍有50%以上的酶活，在pH4.5-12.0范圍具有良好的pH 穩(wěn)定性，且對(duì)中性和堿性蛋白酶具有極好的抗性。本研究獲得的菌株S. bicolor 能夠產(chǎn)生木聚糖酶，酶催化反應(yīng)活性最適pH 值為5.0，但其在pH4.0-8.5 范圍內(nèi)有較高的酶活性，并且在pH3.0-9.5 范圍內(nèi)酶活性較穩(wěn)定，說(shuō)明供試菌株S. bicolor 產(chǎn)生的木聚糖酶具有一定的耐受堿性條件的能力。真菌吸收營(yíng)養(yǎng)的方式主要有兩種：（1）活養(yǎng)真菌主要通過(guò)菌絲吸收營(yíng)養(yǎng)，供其自身的生長(zhǎng)發(fā)育和細(xì)胞代謝，但這種類(lèi)型多見(jiàn)于植物病原菌。（2）營(yíng)腐生的真菌通過(guò)分泌降解酶分解有機(jī)物，獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。棲息于高寒草地土壤環(huán)境中的真菌生長(zhǎng)速度很慢，通過(guò)菌絲吸收營(yíng)養(yǎng)維持生命的可能性較小，而通過(guò)分泌木質(zhì)纖維素酶降解有機(jī)物來(lái)吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的可能性大。因此，供試菌株以后者來(lái)吸收營(yíng)養(yǎng)的方式的可能性大。真菌分泌的酶的性質(zhì)和酶活力也可能與棲息環(huán)境條件有關(guān)，但試驗(yàn)結(jié)果顯示，供試菌株在低溫條件下木聚糖酶的活性并不是很高，可能存在分泌其它耐低溫降解酶分解有機(jī)質(zhì)來(lái)吸收營(yíng)養(yǎng)的機(jī)制。農(nóng)作物秸稈主要以植物細(xì)胞壁為主，由大量的有機(jī)物（80%-90%）和少量的礦物質(zhì)及水構(gòu)成的，其有機(jī)物主要成分為粗纖維和無(wú)氮浸出物，還有少量的粗蛋白和粗脂肪，主要含有纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、多糖類(lèi)、樹(shù)膠、其他碳水化合物、蛋白質(zhì)和其他含氮化合物［41］。采用堿化法和氨化法相結(jié)合處理農(nóng)作物秸稈時(shí)會(huì)取得更好的效果［42］，大量試驗(yàn)也證實(shí)添加一定比例的尿素可以提高秸稈干物質(zhì)的降解率，可消化率和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［43-48］。從本研究結(jié)果來(lái)看，供試菌株不僅能夠利用尿素作為氮源，而且其產(chǎn)生的木聚糖酶在堿性環(huán)境下穩(wěn)定性較好。由此可見(jiàn)，本研究獲得的菌株在農(nóng)作物秸稈飼料化資源利用方面具有一定的應(yīng)用潛力。

已有的研究發(fā)現(xiàn)，用于木質(zhì)纖維素降解的酶主要有羧甲基纖維素酶、濾紙?zhí)敲傅人饷福?9］，但由于纖維素通常與木質(zhì)素緊密鏈接，只有脫木質(zhì)化后的纖維素才能夠被微生物降解［50，51］。郝杰杰等［52］對(duì)馬尾松（Pinus massoniana Lamb.）落葉分解的研究中也發(fā)現(xiàn)，鏈格孢（Alternaria sp.）、青霉（Penicillium sp.）、頭孢霉（Cephalosporium sp.）、木霉（Tricherderma sp.）、擬盤(pán)多毛孢菌（Pestalotiopsis sp.）和煙曲霉（Aspergillus fumigatus）等6 種半知菌前期的降解主要依賴(lài)于羧甲基纖維素鈉酶和濾紙酶，后期則通過(guò)木質(zhì)素酶和纖維素酶協(xié)同作用來(lái)降解木質(zhì)纖維素。曹春蕾等［53］研究發(fā)現(xiàn)，桑木層孔菌（Phellinus mori）擁有豐富的胞外酶系，包括淀粉酶、果膠酶、羧甲基纖維素酶和漆酶，各種胞外酶的酶活力隨發(fā)酵時(shí)間而變化，不同酶的產(chǎn)生時(shí)間和酶活力有很大差異，認(rèn)為胞外酶可以直接影響真菌對(duì)于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用，其活性大小和生長(zhǎng)狀況密切相關(guān)。蘆光新等［21］研究發(fā)現(xiàn)，多年生黑麥草（Lolium perenne L.）和白三葉（Trifolium repens L.）的凋落物在液體發(fā)酵過(guò)程中，能夠誘導(dǎo)真菌無(wú)性腔胞綱真菌Microdochium bolleyi 分泌木質(zhì)纖維素酶，包括漆酶、纖維素酶、木聚糖酶、鄰苯二酚氧化酶和愈創(chuàng)木酚氧化酶，不同的凋落物誘導(dǎo)產(chǎn)酶活力大小不同，真菌分泌酶活力的高低和凋落物細(xì)胞壁物質(zhì)降解率之間在一定程度上存在因果關(guān)系。司靜和崔寶凱［54］也研究發(fā)現(xiàn)絨毛栓孔菌（Trametes pubescens）在發(fā)酵過(guò)程中胞外酶的活性變化，與菌絲體生長(zhǎng)狀況密切相關(guān)，不同的酶其分泌高峰期可以作為判斷菌絲體營(yíng)養(yǎng)利用情況和培養(yǎng)周期的依據(jù)。Atif 等［55］也研究指出，木質(zhì)纖維素分解后產(chǎn)生的糖，對(duì)后續(xù)分解有阻遏作用。以上的研究說(shuō)明，大多數(shù)真菌在降解木質(zhì)纖維素的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生多種類(lèi)型的降解酶系，通過(guò)這些酶的協(xié)同作用將木質(zhì)纖維素類(lèi)物質(zhì)降解成小分子的化合物，并且生成的新的化合物會(huì)影響真菌的生長(zhǎng)和再次誘導(dǎo)產(chǎn)酶過(guò)程，因此，纖維素類(lèi)物質(zhì)的組分和真菌的種類(lèi)與真菌產(chǎn)酶類(lèi)型和活性密切。

4 結(jié)論

篩選自高寒草地產(chǎn)木聚糖酶真菌Saccharicola bicolor 在15-40℃溫度范圍內(nèi)能夠生長(zhǎng)，其最適生長(zhǎng)溫度為35℃；對(duì)5 種碳源利用情況的先后順序?yàn)椋蝴溠刻牵镜矸郏菊崽牵竞酒咸烟?，?duì)5 種氮源利用情況的先后順序?yàn)椋旱鞍踪|(zhì)＞磷酸銨＞硫酸銨＞硝酸鈉＞尿素。菌株S. bicolor 誘導(dǎo)后分泌的木聚糖酶在40-60℃下有較高的催化活性，55℃時(shí)酶的催化活性達(dá)到最大值，在pH4.0-8.5 范圍內(nèi)，酶的催化活性較高，酶反應(yīng)最適pH 值為5.0，且在pH3.0-9.5 范圍內(nèi)酶活性較穩(wěn)定，供試菌株產(chǎn)生的木聚糖酶有一定的耐堿性。

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