殺真菌素鏈霉菌AL-04 的篩選與鑒定

李增波 孫紅艷 趙靜嫻 周劍武 梁棟 高曄

（太原科技大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，太原 030021）

近年來，隨著設(shè)施園藝的迅速發(fā)展，各種植物病害相繼出現(xiàn)，其中土傳真菌病害尤為嚴(yán)重，已成為制約設(shè)施農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要因素［1］。目前，土傳病害主要采用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治，但防效不佳，且存在易污染環(huán)境、病原菌耐藥性及成本較高等問題，無法適應(yīng)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的需要。放線菌是農(nóng)用抗生素的主要產(chǎn)生菌，其在防治土傳病害、改善植物營養(yǎng)和土壤理化性狀等方面具有顯著作用，正越來越受到人們的關(guān)注和重視［2］。本研究依賴本實(shí)驗(yàn)室建立的放線菌庫，主要針對(duì)目前生產(chǎn)上發(fā)病面積較廣，對(duì)園藝作物生產(chǎn)影響較大的土傳真菌病害，采用瓊脂擴(kuò)散法、生長速率法、孢子萌發(fā)抑制法及離體組織法，篩選高效且活性穩(wěn)定的拮抗菌株，旨在探索新的土傳病害生防途徑，并為商品化生防菌劑的開發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試放線菌 通過平皿體外試驗(yàn)，從青藏高原土壤中分離純化到的4 500 余株放線菌［3，4］中篩選得到13 株放線菌。

1.1.2 活性檢測(cè)靶標(biāo)菌 辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici，代號(hào)為P3）、黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum，代號(hào)為H）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. niveum，代號(hào)為X）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea，代號(hào)為F）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureaus，代號(hào)為A）、埃希氏大腸桿菌（Escherichia coli，代號(hào)為E）、青霉（Penicillium，代號(hào)為P）、白色假絲酵母（Candida albicans，代號(hào)為Y）、黑曲霉（Aspergillus niger）、木霉（Trichoderma sp.），均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 培養(yǎng)基 肉胨培養(yǎng)基［5］、高氏1 號(hào)培養(yǎng)基［5］、PDA 培養(yǎng)基［5］、改良PDA 培養(yǎng)基［3］、黃豆粉培養(yǎng)基［3］、發(fā)酵培養(yǎng)基（黃豆粉 20 g，蔗糖 3 g，蛋白胨 2 g，淀粉 10 g，酵母膏 2 g，NaCl 2 g，K2HPO41 g，ZnSO40.01 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCO32 g，水 1 000 mL，pH7.2），所有試劑均為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌株的篩選

1.2.1.1 瓊脂擴(kuò)散法［6］將13 株放線菌分別制成菌懸液，取100 μL 菌懸液涂布接種在黃豆粉培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d 后，用打孔器打取7 mm 菌餅放入指示菌平板上，設(shè)3 個(gè)平行。于28℃培養(yǎng)3 d 后，十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.1.2 生長速率法［6］將13 株放線菌分別制成孢子懸浮液，孢子懸浮液按10%（V/V）的接種量接種于裝有50 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的300 mL 搖瓶中，28℃，180 r/min 振蕩培養(yǎng)5 d 后，于5 000 r/min 離心，用0.22 μm 濾膜過濾除菌得到無細(xì)胞濾液。取5 mL 無細(xì)胞濾液，按濾液∶培養(yǎng)基=1∶5 的比例與25 mL的PDA 培養(yǎng)基（滅菌后冷卻至50℃左右）混合，待凝固后，將預(yù)先培養(yǎng)5 d 的7 mm 病原菌菌餅（西瓜枯萎、黃瓜枯萎、番茄灰霉、辣椒疫霉）放置于混配平板上，每個(gè)處理3 個(gè)平行，28℃培養(yǎng)72 h 后將培養(yǎng)皿取出，用游標(biāo)卡尺測(cè)量菌落直徑（十字交叉測(cè)量?jī)纱?，取平均值），? 次平行菌落直徑的平均值計(jì)算抑菌率。

1.2.1.3 真菌孢子萌發(fā)情況測(cè)定［7］取上述無細(xì)胞濾液1 mL，加入10 mL 無菌水，分別接入4 種真菌（黑曲霉、青霉、木霉和辣椒疫霉）孢子懸浮液100 μL，孢子濃度為鏡檢時(shí)40 倍視野下孢子數(shù)30-50 個(gè)。28℃培養(yǎng)6 h 后，取50 μL 于載玻片上，在40 倍鏡下觀察孢子萌發(fā)情況（萌發(fā)率和抑制率）。

1.2.1.4 離體葉片法［8］同1.2.1.2 方法得到13 株放線菌的無細(xì)胞濾液。取無細(xì)胞濾液20 mL 加入無菌培養(yǎng)皿，同時(shí)再取一個(gè)無菌培養(yǎng)皿加入20 mL 滅菌清水作為空白對(duì)照。剪取生長整齊一致的植物葉片（辣椒、黃瓜、番茄）用清水洗凈，分別放入裝有以上兩種溶液的平皿中浸泡30 min，取出葉片瀝干濾液，取無菌培養(yǎng)皿，放入一張與平皿大小一致的無菌濾紙，并加入無菌水4 mL，將已晾干的葉片放在吸水濾紙上，把一個(gè)活化好的直徑7 mm 的病原菌菌餅放于葉片上，蓋上平皿置28℃保溫保濕培養(yǎng)，檢查葉片染病情況及防治效果。每個(gè)處理50 個(gè)重復(fù)。

1.2.2 拮抗菌株的鑒定

1.2.2.1 形態(tài)特征 采用高氏1 號(hào)平板培養(yǎng)基進(jìn)行埋片培養(yǎng)（30℃，7 d）。取埋片用2.5%戊二醛固定12 h 后，用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH7.2）漂洗3次，轉(zhuǎn)入1%鋨酸溶液中固定1 h，再用上述緩沖液漂洗3 次，分別經(jīng)50%-100%乙醇梯度脫水，置醋酸異戊酯中20 min，取出，臨界點(diǎn)干燥，噴金后于掃描電子顯微鏡下觀察菌體形態(tài)特征［9］。

1.2.2.2 培養(yǎng)特征和生理生化特征 參照《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》推薦的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基和常用生理生化方法培養(yǎng)、觀察和記錄［10］。

1.2.2.3 細(xì)胞化學(xué)分析 采用Hasegawa 等［11］和王平［12］改進(jìn)的快速薄層層析法進(jìn)行全細(xì)胞氨基酸及全細(xì)胞水解液糖型的分析。

1.2.2.4 抗藥性測(cè)定 把各種抗生素按一定濃度配制好，待滅完菌的高氏培養(yǎng)基的溫度降低到50℃左右時(shí)，再把抗生素加到培養(yǎng)基中充分混勻，倒平板備用。將預(yù)先培養(yǎng)好的菌體用接種針輕輕點(diǎn)接在平板上。以不加抗生素的高氏平板作為陰性對(duì)照，30℃下培養(yǎng)7-14 d 后記錄結(jié)果。培養(yǎng)基中抗生素利福平、諾弗沙星、鏈霉素、紅霉素、氯霉素、氨芐青霉素、卡那霉素、慶大霉素的濃度為0.25 mg/mL，環(huán)丙沙星、青霉素濃度為5.0 mg/mL。

1.2.2.5 基于16S rDNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析 參照文獻(xiàn)［13］的方法提取基因組DNA，然后PCR 擴(kuò)增16S rDNA 基因。其中PCR 擴(kuò)增引物采用通用引物，即正向Pf：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'；反向Pr：5'-TACGGCTACCTTGTTACGACT-3'。PCR 擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，57℃退火1 min，72℃延伸2 min，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物純化與序列測(cè)定由上海生物工程公司完成。16S rDNA 基因測(cè)序后，利用Blast 搜索引擎從GenBank 數(shù)據(jù)庫中調(diào)出相關(guān)放線菌菌株的16S rDNA 基因序列，用Clustal X 軟件進(jìn)行多序列比對(duì)并計(jì)算供試菌株與參比菌株之間的序列相似性，用Mega 3.1 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 采用Excel 2003 及SAS 8.2 進(jìn)行相關(guān)處理的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和方差分析。

2 結(jié)果

2.1 拮抗菌株的篩選

2.1.1 離體拮抗性試驗(yàn)結(jié)果 為了獲得廣譜活性菌株，通過瓊脂平板拮抗性試驗(yàn)，對(duì)13 株供試放線菌進(jìn)行初篩。結(jié)果（表1）顯示，供試13 株放線菌均對(duì)4 種以上的病原菌有拮抗作用，抑菌圈直徑均在14.0 mm 以上。其中對(duì)5 種病原菌有抑制作用的菌株有AL-06、AL-07 和AL-10；對(duì)7 種病原菌有抑制作用的菌株有AL-03、AL-04，其中AL-04 的抑菌圈直徑平均為20.0 mm 以上，表現(xiàn)出較強(qiáng)的生物活性。

表1 13 株放線菌的抑菌圈直徑（mm）

2.1.2 供試菌株對(duì)病原菌菌絲生長的抑制作用 為了篩選到抗病原真菌的高效菌株，采用生長速率法對(duì)上述菌株進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果（表2）顯示，對(duì)西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. niveum）抑制率達(dá)50%以上的菌株為AL-04、AL-06 和AL-10，其中AL-10 菌株的抑制率為93.9%；對(duì)黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum）抑制率達(dá)50%以上的菌株為AL-04、AL-05、AL-08 和AL-10，其中AL-04 的抑制率為85.7%；對(duì)番茄灰霉病菌（Botrytis cinere）抑制率達(dá)50%以上的菌株為AL-04、AL-10，其中AL-10 的抑制率為77.8%；對(duì)辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）抑制率達(dá)50%以上的菌株為AL-02、AL-03、AL-04、AL-05、AL-06、AL-10、AL-11 和AL-13，其中AL-02 的抑制率為95.3%。由此可知，供試13 株拮抗菌中，對(duì)4 種病原病菌抑制效果（抑制率>70%）的高效菌株為AL-04 和AL-10。

表2 13 株放線菌對(duì)4 種靶標(biāo)菌的抑菌率（%）

2.1.3 供試菌株對(duì)指示菌孢子萌發(fā)的抑制作用 依據(jù)稻瘟篩選模型，以黑曲霉（Aspergillus niger）、木霉（Trichoderma sp.）、青霉（Penicillium）和辣椒疫霉（Phytophthora capsici）作為指示菌，通過測(cè)定供試菌株發(fā)酵濾液對(duì)其孢子萌發(fā)率的影響，篩選抗植物病原真菌的高效拮抗菌株。結(jié)果（表3）顯示，13 株放線菌的發(fā)酵濾液對(duì)4 種指示菌孢子的萌發(fā)均有不同程度的抑制作用。抑制率均達(dá)到70.0%以上的菌株有AL-03、AL-04、AL-06、AL-07 和AL-10。同生長速率法結(jié)果一致，AL-04 和AL-10 兩株菌仍顯示出高效的拮抗活性。

表3 13 株放線菌對(duì)4 種靶標(biāo)菌孢子萌發(fā)的抑制率（%）

2.1.4 離體葉片試驗(yàn)結(jié)果 在生防菌的篩選過程中，經(jīng)常會(huì)遇到室內(nèi)試驗(yàn)與田間試驗(yàn)結(jié)果差距較大等問題，因而有必要建立離體植物組織篩選模式，以檢測(cè)生防菌的活性和生防效果。離體組織測(cè)定法是介于體外抗菌活性測(cè)定法和植物測(cè)定法之間的一種測(cè)定方法，它既可保證一定數(shù)量的菌株篩選，也能使測(cè)定條件比較接近大田條件。離體葉片法是離體組織測(cè)定法中最常用的一種方法，離體葉片法與植株法比較具有占用空間小、試驗(yàn)條件容易控制、方便、快速等優(yōu)點(diǎn)，是室內(nèi)抗性鑒定的好方法。

辣椒、黃瓜、番茄均為常見園藝作物，其易受病害危害且材料容易獲取，因此取其進(jìn)行離體葉片測(cè)定試驗(yàn)。結(jié)果（表4）顯示，供試13 株放線菌對(duì)辣椒疫霉病菌、黃瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌的抑制作用有所不同：AL-02、AL-04、AL-10 和AL-11發(fā)酵液對(duì)辣椒疫霉的防治效果均在70.0%以上，其中AL-04 的 防 治 效 果 達(dá)90.0%；AL-04、AL-08 和AL-10 發(fā)酵液對(duì)番茄灰霉病菌均有抑制作用，防治效果在60%以上，其中AL-04 和AL-10 的防治效果為70.0%；AL-04、AL-05 和AL-10 發(fā)酵液對(duì)黃瓜枯萎病菌有抑制作用，其中，AL-05 和AL-10 的防治效果為70.0%，AL-04 的防治效果為80.0%。

從上述4 種方法的活性檢測(cè)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，AL-04菌株始終表現(xiàn)出很強(qiáng)的生物活性，因此選定AL-04菌株進(jìn)行下一步的研究。

表4 13 株放線菌對(duì)供試植物葉片的防治效果（%）

2.2 AL-04菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)特征 AL-04 放線菌在高氏1 號(hào)培養(yǎng)7 d，菌落呈白色至淡灰色、致密表面、邊緣光滑平坦（圖1-A）。光鏡和掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，該菌株基絲發(fā)育良好，呈現(xiàn)淺黃色，多分枝，無橫隔，不斷裂，氣絲生長旺盛，呈現(xiàn)淡紫灰色，寬0.4-0.5 μm，在氣絲上生有長孢子鏈，為松弛疏螺旋，孢子鏈長，分化為孢子，孢子球形至卵圓型，表面光滑無刺，直徑0.5 μm 左右（圖1-B 和1-C）。

2.2.2 培養(yǎng)特征 AL-04 菌株在葡萄糖-天冬酰胺瓊脂上基內(nèi)菌絲為乳白色，氣生菌絲發(fā)達(dá)為淺橄欖石灰；在甘油-蘋果酸鈣瓊脂上，基內(nèi)菌絲為杏仁黃，氣生菌絲為繭白色；在淀粉-酪蛋白瓊脂上，基內(nèi)菌絲為荔肉白色，氣生菌絲為灰白色；在察貝克氏瓊脂上，基內(nèi)菌絲為豆汁黃色，氣生菌絲為鴿子灰色；在麥芽汁-酵母膏瓊脂（ISP2）上，基內(nèi)菌絲為乳白色，氣生菌絲為艾綠色；在燕麥片瓊脂（ISP3）上，基內(nèi)菌絲為蓮子白色，氣生菌絲為銀灰色；在酵母膏-淀粉瓊脂上，基內(nèi)菌絲為蚌肉白色，氣生菌絲為灰白色；在無機(jī)鹽-淀粉瓊脂（ISP4）上，基內(nèi)菌絲為淡繭黃色，氣生菌絲為淡紫灰色；在甘油-天冬酰胺瓊脂（ISP5）上，基內(nèi)菌絲為乳白色，氣生菌絲為淡綠色；在馬鈴薯塊上，基內(nèi)菌絲為橄欖石灰色，氣生菌絲為淡紫灰色。該菌在各培養(yǎng)基上均無可溶性色素產(chǎn)生。

2.2.3 唯一碳、氮源利用和生理生化特征 AL-04菌株能利用D-葡萄糖、D-木糖、D-果糖、鼠李糖、蔗糖、DL-肌醇、D-甘露醇、半乳糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖、甘油、山梨醇、丙酮酸、丁二酸鈉等碳源，不利用L-阿拉伯糖、棉子糖、醋酸鈉、檸檬酸鈉、草酸鈉、馬尿酸鈉、酒石酸鈉；可以利用酪氨酸、絲氨酸、DL-天冬氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、腺嘌呤、尿素、KNO3、NaNO3、（NH4）2SO4等氮源。該菌能使明膠液化和分解纖維素，并使石蕊變藍(lán)和淀粉水解，硝酸鹽還原和卵磷脂酶反應(yīng)陽性，不胨化和凝固牛奶，不產(chǎn)生H2S 和黑色素。最適生長溫度為24-32℃，低于14℃和高于38℃則停止生長。

2.2.4 細(xì)胞壁氨基酸分析 AL-04 菌株細(xì)胞壁中含有L-DAP（L 型二氨基庚二酸）和甘氨酸，屬于Ⅰ型細(xì)胞壁，符合鏈霉菌屬（Streptomyces）的化學(xué)分類特性。

2.2.5 耐藥性分析 AL-04 菌株能在利福平、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、紅霉素、氯霉素、青霉素、氨芐青霉素的平板上生長，不能在鏈霉素慶、大霉素、卡那霉素的平板上生長。

圖2 基于16S rDNA 的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2.6 分子鑒定結(jié)果 菌株AL-04 的16S rDNA 核酸序列長度為1 448 bp，GenBank 登錄號(hào)為JN368424。通過與NCBI 中模式菌株的16S rDNA 序列比對(duì)分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建（圖2），發(fā)現(xiàn)菌株AL-04 與殺真菌素鏈霉菌（Streptomyces fungicidicus）的4 個(gè)菌株在進(jìn)化樹上位于同一個(gè)分支，其中與Streptomyces fungicidicus MML1614（EU344795）同源性達(dá)到99.6%。因此，參照鏈霉菌的分類鑒定手冊(cè)，結(jié)合菌株AL-04 的形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征以及細(xì)胞壁化學(xué)分析，將菌株AL-04 歸為殺真菌素鏈霉菌（Streptomyces fungicidicus）。

3 討論

活性菌株初篩法多采用平皿拮抗測(cè)定和活體植株測(cè)定，前者雖反映離體抑菌作用，但與盆栽及大田植株測(cè)定結(jié)果相關(guān)性很低，而后者工作量又太大，影響篩選進(jìn)度。本研究采用蔬菜離體葉片平皿培養(yǎng)測(cè)定法則可彌補(bǔ)兩者不足之處，它可以把體外無效、體內(nèi)有效的活性菌株篩選出來，極大地縮短初篩周期并提高篩選的準(zhǔn)確性。在該方法的基礎(chǔ)上再進(jìn)行盆栽及大田測(cè)定，可顯著減少工作量，提高篩選水平。

實(shí)踐證明，新型高效農(nóng)用抗生素的發(fā)現(xiàn)與新的篩選模型的構(gòu)建關(guān)系緊密。如以觀察稻瘟菌分生孢子或菌絲形態(tài)生長異常為指標(biāo)的簡(jiǎn)易微管測(cè)試體系［16］，篩選出多種具有抗有絲分裂、抗真菌活性的新化合物，其中rhizoxin 和fusaridin A 已開發(fā)為抗腫瘤、抗真菌新藥［17，18］。國內(nèi)的林厚文等［19］利用該模型篩選到海兔中抗有絲分裂活性組分；鮑時(shí)翔等［20］參照該模型建立了鐮刀菌篩選模型，并將其與腫瘤細(xì)胞毒篩選模型組合，應(yīng)用于海洋微生物抗腫瘤活性物質(zhì)的篩選。孢子萌發(fā)法篩選病原真菌的拮抗菌株時(shí)，常常需要培育病原菌的孢子，但其培養(yǎng)存在費(fèi)時(shí)費(fèi)力和離體條件毒性不高的弊端，能否采用更簡(jiǎn)潔的方法用于活性菌株的篩選，特別是應(yīng)用于大量備選菌株庫的初篩工作，是菌株篩選過程中亟待解決的問題。本研究借鑒稻瘟菌篩選模型，以黑曲霉、木霉和青霉3 種常見非植物病原真菌和植物病原真菌辣椒疫霉作為指示菌，進(jìn)行孢子萌發(fā)抑制試驗(yàn)。結(jié)果顯示，對(duì)4 種指示菌孢子萌發(fā)抑制率均達(dá)到70.0%以上的活性菌株占供試菌株總數(shù)的38.5%，這部分活性菌株對(duì)3 種非植物病原真菌孢子萌發(fā)抑制率達(dá)到73%-98%，同時(shí)對(duì)病原真菌的孢子萌發(fā)抑制率也達(dá)到了70%-88%，說明活性菌株對(duì)非病原真菌和病原真菌的抑制作用存在一定的偶聯(lián)關(guān)系，而且黑曲霉、木霉和青霉產(chǎn)孢子比辣椒疫霉產(chǎn)孢子更加容易，檢測(cè)時(shí)從加樣到觀察所需時(shí)間更短（前者只需6-10 h，而后者一般要12-16 h）。因此，上述試驗(yàn)結(jié)果提供了一個(gè)農(nóng)用抗生素篩選模型的新思路，即活性菌株若對(duì)易培養(yǎng)真菌孢子萌發(fā)有抑制作用，其很可能對(duì)病原真菌孢子也存在一定的抑制作用。因此，在實(shí)際操作過程中，可以選擇易培養(yǎng)的非病原真菌作為初篩工作的靶標(biāo)菌，從而縮短篩選周期。本研究結(jié)果是對(duì)該思路的一個(gè)初步探索，其驗(yàn)證工作還有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

參照稻瘟菌篩選模型，以非植物病原真菌和植物病原真菌作為指示菌，篩選到一株具有廣譜的抗菌活性的菌株AL-04，其對(duì)幾種常見的園藝植物土傳病害病原真菌都有較強(qiáng)的抑制效果，抑制率超過70.0%，其中對(duì)辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）抑制率高達(dá)93.0%，有較高的應(yīng)用價(jià)值。經(jīng)形態(tài)、培養(yǎng)特征、生理生化特征、全細(xì)胞壁氨基酸和糖型分析以及16S rDNA 序列聚類分析，將AL-04 鑒定為殺真菌素鏈霉菌（Streptomyces fungicidicus）。

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