甘肅不同地區(qū)綿羊TLR9 基因多態(tài)性分析

呂偉麗 張小麗 馬小軍，2 張國華

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070；2.甘肅省草食動物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070）

綿羊的呼吸道疾病主要是由羊肺炎支原體、巴氏桿菌、綠膿桿菌及C 群肺炎鏈球菌等病原微生物引起的呼吸道傳染病，主要以咳嗽、氣喘及肺炎為特征，羊患病后生長不良，掉膘，病情嚴(yán)重且得不到及時治療時會引起羊只死亡。綿羊呼吸道疾病在每年冬春發(fā)病，發(fā)病率和死亡率均較高，嚴(yán)重影響?zhàn)B羊業(yè)的發(fā)展［1-3］。隨著分子遺傳技術(shù)的發(fā)展，探討疾病控制的分子機(jī)制成為可能。免疫分子的Toll樣受體家族（Toll-like receptor，TLRs）的多態(tài)性或差異與動物對病原的抵抗力和易感性有著顯著的相關(guān)［4］。TLR 是單個的跨膜非催化性蛋白質(zhì)，可以識別來源于微生物的具有保守結(jié)構(gòu)的分子［5］。當(dāng)微生物突破機(jī)體的物理屏障，如皮膚、黏膜等時，TLR 可以識別它們并激活機(jī)體產(chǎn)生免疫細(xì)胞應(yīng)答［6］。TLR9 是TLRs 中的一員，可能是天然免疫識別微生物機(jī)制中對革蘭氏陰性菌表達(dá)的內(nèi)毒素-脂多糖應(yīng)答的受體［5，7］。TLR9 基因與呼吸道疾病抗性相關(guān)。本研究對綿羊該基因的遺傳多態(tài)性進(jìn)行分析，結(jié)合表型觀測資料，初步確定易感等位基因和抗性較強(qiáng)的等位基因。研究表明Toll 樣受體（TLRs）是識別病原體和激活機(jī)體固有免疫的重要組成部分，與增加人對各種疾病的易感性有較大的關(guān)系，如艾滋?。?］、麻風(fēng)?。?］，或者是動物如牛的副結(jié)核［1，2］，豬的沙門氏菌病［9］。脊椎動物的免疫系統(tǒng)中的甲基化的CpG 二核苷酸序列，其主要功能是識別侵入機(jī)體的細(xì)菌等［5］，這種識別PAMP 分子模式的受體稱為Toll 樣受體9［10］。在小鼠的抗原抗原呈遞細(xì)胞（APC）中合成含CpG 寡脫氧核苷酸（核苷酸），并模仿細(xì)菌的CpG 的核苷酸和誘導(dǎo)生產(chǎn)的細(xì)胞因子［10］，如B 細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（DC）［11］。據(jù)報道，綿羊和黃牛TLR 是蜂窩模式的CpG ODN 誘導(dǎo)，與人類有許多相似之處［12］。然而，這之間有種間差異也有種內(nèi)差異，牛和羊因CpG 寡核苷酸的類型的不同而導(dǎo)致免疫反應(yīng)不同，但對其原因缺乏深入了解［13］。有研究表明，面對體外環(huán)境（空氣灰層較多）和體內(nèi)環(huán)境（細(xì)菌入侵）的變化，TLR 配體可能會受到Toll 樣受體基因單核苷酸多態(tài)性的影響，作出適應(yīng)性反應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)菌感染或炎癥性疾病的易感性的改變［6］。目前在國內(nèi)外還未見有關(guān)中國綿羊TLR9 基因的研究報道。本研究針對中國綿羊群體，收集表型正常和患有呼吸道疾病的個體基因組DNA樣品，開展TLR9 基因的遺傳多態(tài)性分析。利用已有的綿羊呼吸道病表型觀測和對應(yīng)的基因組DNA 樣品為基礎(chǔ)，采用有效的SNPs 檢測方法PCR-SSCP，檢測綿羊TLR9 基因的遺傳多態(tài)性，通過序列測定確定變異類型，根據(jù)表型初步判定易感呼吸道疾病的等位基因。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究在甘肅省山丹縣某規(guī)?；B(yǎng)殖場采集107 份表型正常的小尾寒羊血液樣品；甘肅省永昌縣某規(guī)?；驁霾杉硇驼Ｐ∥埠蜓簶悠?16 份，患呼吸道疾病的綿羊血液樣品36 份；甘肅省隴西縣某規(guī)?；驁霾杉硇驼Ｐ∥埠蜓簶悠?04 份，患呼吸道疾病的綿羊血液樣品22 份（表1）。每只羊均頸靜脈采血10 mL，檸檬酸葡萄糖（ACD）抗凝，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

表1 綿羊樣品采集記錄

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 提取 采用常規(guī)的酚/氯仿提取法，從血樣中提取DNA 并溶解于TE 緩沖液，在1%瓊脂糖凝膠，200 V 電泳檢測后，放于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計及PCR 擴(kuò)增 采用Primer 5.0 引物設(shè)計軟件，根據(jù)GenBank 發(fā)表的綿羊TLR9 基因核苷酸全序列（AY859727）設(shè)計其核苷酸序列引物（上游引物：5'-TTCGTGGACCTGTCGGAC-3'，下游引物5'-CTGGCTGTTGTAGCTGAG-3'），擴(kuò)增目的片段約為414 bp，引物由上海生工生物有限公司合成。

PCR 擴(kuò)增采用20 μL 的體系，各成分用量：上下游引物個0.4 μL，模板DNA 0.8 μL，滅菌ddH2O 6.4 μL，DNA-TAQ 預(yù)混酶12 μL。PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 1 min；變性95℃ 45 s，退火60℃ 30 s，延伸72℃ 54 s，35 個循環(huán)；最后延伸72℃ 10 min。4℃保存，PCR 產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 PCR 產(chǎn)物的SSCP 檢測 取2.5 μL PCR 產(chǎn)物，7.5 μL 變性劑（98%去離子甲酰胺、0.03%二甲苯青、0.025%溴酚藍(lán)、0.5 mol/L 混合而成），經(jīng)105℃變性5 min，然后放置于冰上10 min，在12%非變性聚丙烯酰胺凝膠（acr∶bis=37.5∶1），4℃、240 V，電泳24 h，結(jié)束后銀染法顯色。

1.2.4 TLR9 基因測序 SSCP 分析之后，選取不同基因型個體PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物基因科技股份有限公司測序。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 用DNAMAN、Dnasp4.0［14］進(jìn)行核苷酸變異位點(diǎn)、氨基酸變異位點(diǎn)的分析，系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建；Megalign［15］、Clustal［7］對所測的綿羊TLR9 基因序列進(jìn)行同源序列比對分析。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增

對采集的綿羊TLR9 基因進(jìn)行擴(kuò)增，得到414 bp 的擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的條帶清晰且無雜物（圖1），可以進(jìn)行下一步的SSCP分析。

圖1 TLR9 基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2 PCR-SSCP檢測結(jié)果

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)SSCP 分析，所檢測的485 只綿羊中共發(fā)現(xiàn)4 個等位基因，分別指定為TLR9 的*A、*B、*C、*D。各等位基因的電泳帶從1 條到5條不等，結(jié)果見圖2。

圖2 TLR9 基因SSCP 電泳圖譜

2.3 綿羊TLR9基因多態(tài)位點(diǎn)、等位基因頻率與氨基酸差異分析

本研究共確定4 個不同的序列（圖3）。在序列分析中，發(fā)現(xiàn)了7 個核苷酸多態(tài)位點(diǎn)，占分析位點(diǎn)總數(shù)的1.69%。其中轉(zhuǎn)換4 個，占核苷酸多態(tài)位點(diǎn)的57.14%，包括C/T 轉(zhuǎn)換1 個，G/A 轉(zhuǎn)換2 個，G/T轉(zhuǎn)換一個；顛換3 個，占多態(tài)位點(diǎn)總數(shù)42.86%。

用綿羊TLR9 部分基因序列推導(dǎo)出氨基酸序列（圖4），共有4 個氨基酸位點(diǎn)發(fā)生突變，其中單一氨基酸突變位點(diǎn)2 個。B 等位基因的72 bp 處C/T 和A、D 等位基因201 bp 處G/C，G/A 突變，沒有引起氨基酸的變化。

2.4 綿羊TLR9基因座位等位基因頻率

根據(jù)PCR-SSCP 的檢測結(jié)果，485 只綿羊TLR9基因存在的等位基因頻率分布情況（表2）。其中等位基因B 的頻率最高，達(dá)到51.13%，其次為等位基因 A。在觀測的485 只試驗(yàn)綿羊中，表型正常的個體 427 只（健康未患呼吸道疾?。硇彤惓５?8只（患有呼吸道疾?。＿M(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，患呼吸道疾病羊只中等位基因 D 的頻率最高（表3）。

2.5 綿羊TLR9基因同源樹的構(gòu)建

為了分析綿羊TLR9 基因的等位基因與其它相應(yīng)等位基因間的遺傳關(guān)系，利用DNAMAN 軟件對TLR9 基因的序列進(jìn)行同源樹的構(gòu)建（圖5）。所用序列包括本研究獲得的4 個單倍型序列，從GenBank下載以下序列參與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建：EF656460，JN377802，HQ717158，HQ717159，HQ717160，JN377803，HQ434578，EF656459，EF656458，NM001011555，AM231305，AM981307，GU451250，AY859727。圖5 顯示，綿羊TLR9 基因在國內(nèi)外各個品種之間的同源性非常高，遺傳關(guān)系很近。

3 討論

3.1 綿羊TLR9基因多態(tài)性

研究表明，由于產(chǎn)生多態(tài)性的機(jī)制主要是基因突變和轉(zhuǎn)換，所以TLR9 基因多態(tài)性可能就是在長期的進(jìn)化過程中等位基因的積累、融合與分化形成的。適應(yīng)是形成TLR9 多態(tài)性的動因［6］，其多態(tài)性表現(xiàn)出明顯的適應(yīng)意義，如抗病力增強(qiáng)，對環(huán)境的適應(yīng)性增強(qiáng)等，這樣就會出現(xiàn)有利的選擇，群體中的基因頻率就會發(fā)生改變，有利的基因在群體中逐漸的積累；不利的基因會逐漸的消失。免疫系統(tǒng)的功能是決定家畜適應(yīng)外界環(huán)境能力的因素［16］，由于家畜所處的環(huán)境（地理環(huán)境和氣候環(huán)境）的差別較大，為了更好適應(yīng)所處的環(huán)境，機(jī)體的免疫系統(tǒng)會表現(xiàn)出豐富的多態(tài)性［17］，編碼TLR9 最主要功能區(qū)的基因也會表現(xiàn)出豐富的多態(tài)性。本研究在綿羊TLR9 基因中發(fā)現(xiàn)等位基因4 個，多態(tài)位點(diǎn)7 個，占序列總長度的1.67%，具有高度的多態(tài)性，這與綿羊所處的環(huán)境（甘肅省氣候干燥，空氣中灰塵中）所具有的適應(yīng)性強(qiáng)，抗病性強(qiáng)的特點(diǎn)一致。

圖3 TLR9 等位基因核苷酸序列比對結(jié)果

圖4 TLR9 等位基因氨基酸序列對比結(jié)果

表2 綿羊TLR9 等位基因頻率

表3 患呼吸道綿羊TLR9 等位基因頻率

圖5 TLR9 基因核苷酸序列的同源樹

動物TLRs 與疾病的易感性和抗性有關(guān)［6］。TLR9 基因多態(tài)性和遺傳性的功能是防止機(jī)體受到疾病的感染。免疫學(xué)研究揭示，可以采用免疫遺傳標(biāo)記開展選種工作，以提高畜禽的抗病力［18，19］。在動物的抗病育種中，許多研究表明TLRs 基因可能是一組重要的候選基因，能用于抗病分子的育種實(shí)踐之中。本研究選擇患呼吸道病的綿羊中，D 等位基因的頻率最高；未患呼吸道疾?。ū硇驼＃┑木d羊中，A、B 等位基因的頻率最高，可以初步推斷A、B 等位基因具有較強(qiáng)的抗呼吸道疾病的遺傳潛力。

3.2 TLR9基因聚類分析

TLR9 基因的同源樹圖表明，在綿羊的進(jìn)化過程中，TLR9 基因最早可能來源于它們分歧之前的共同祖先原始序列，這可能是它們對相同病原微生物發(fā)生特定免疫反應(yīng)的有效證據(jù)，具有相似性。

4 結(jié)論

研究獲得4 個TLR9 基因的等位基因，在該區(qū)域中發(fā)現(xiàn)了7 個SNPs，主要是由點(diǎn)突變形成的，說明綿羊TLR9 基因具有較豐富的多態(tài)性。

發(fā)現(xiàn)患有呼吸道病個體中等位基因D 的頻率最高，在4 個等位基因中都有出現(xiàn)。TLR9 基因多態(tài)性與綿羊呼吸道疾病有一定的相關(guān)性。

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