ABA 相關(guān)基因抗旱基因工程研究進(jìn)展

田孝威 彭守華 尉繼強(qiáng) 姜勇 王志強(qiáng) 王化琪

（1.威海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，威海 264200；2.煙臺(tái)市福山區(qū)植保站，煙臺(tái) 265500；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100193）

干旱嚴(yán)重影響著作物的生長發(fā)育，造成作物減產(chǎn)，威脅著人類的生存發(fā)展。培育抗旱高產(chǎn)作物是全世界生物學(xué)家面臨的亟待解決的課題。隨著分子生物學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，植物抗旱機(jī)理研究已經(jīng)取得長足的進(jìn)展，結(jié)合植物基因工程可以培育出抗旱轉(zhuǎn)基因作物。脫落酸（Abscisic acid，ABA）合成和信號(hào)通路的基因在植物抗旱過程中發(fā)揮了巨大作用，目前已經(jīng)有許多基因工程方面的相關(guān)研究（表1）。本文綜述了近幾年ABA 相關(guān)基因抗旱基因工程研究的一些進(jìn)展。

1 ABA 與植物的抗旱性

植物內(nèi)源激素之一的脫落酸，在胚胎發(fā)育、種子休眠、葉片衰老等過程中起調(diào)節(jié)作用，同時(shí)，在植物干旱等逆境脅迫過程中起著調(diào)節(jié)因子的作用。在逆境條件下，植物體內(nèi)合成大量的ABA，可以促進(jìn)氣孔關(guān)閉，抑制氣孔開放；降低葉片伸展率，調(diào)整保衛(wèi)細(xì)胞離子通道；促進(jìn)植物根吸收水分，增加共質(zhì)體途徑水流，誘導(dǎo)一系列基因的表達(dá)，增強(qiáng)植物的抗逆性［1］。逆境期間，植物體內(nèi)的ABA 來源于束縛ABA 的釋放和新的大量合成的ABA。干旱初期，束縛型ABA 為ABA 的主要來源，干旱期間，ABA主要來自新合成的ABA。ABA 主要在根部合成，干旱時(shí)，植物的根系感知土壤水分，誘導(dǎo)ABA 合成酶系統(tǒng)，合成大量ABA，然后運(yùn)輸?shù)降厣喜浚偈贡Ｐl(wèi)細(xì)胞關(guān)閉，降低蒸騰作用，減少水分丟失。干旱脅迫時(shí)，外源噴施ABA 可以增強(qiáng)抗氧化酶活性，降低活性氧含量，防止葉綠素降解，增大葉片相對(duì)含水量，減小質(zhì)膜透性及丙二醛含量，增強(qiáng)PSII 的修復(fù)功能［2-5］。

2 ABA 合成相關(guān)基因基因工程

高等植物體內(nèi)的ABA 的生物合成主要有兩種途徑，包括直接途徑和間接途徑。直接途徑，即3 個(gè)異戊烯單位聚合成C15 前體法呢基焦磷酸（Farnesyl pyrophospate，F(xiàn)PP）， 由FPP 經(jīng) 環(huán) 化和氧化直接形成15 碳的ABA。間接途徑，即先由甲羥戊酸（MVA）聚合成C40 前體——類胡蘿卜素，再由類胡蘿卜素裂解成C15 的化合物，如黃質(zhì)醛（Xanthoxin，XAN），最后由黃質(zhì)醛轉(zhuǎn)變成ABA。在高等植物體內(nèi)主要通過間接途徑合成ABA。反應(yīng)過程中的玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶（Zeaxanthin epoxidase，ZEP）［6］、9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶（9-cisepoxycarotenoid dioxygenase，NCED）［7］、醛 氧 化 酶（Abscisic aldehyde oxidase，AAO）［8］及鉬輔因子硫化 酶（Molybdenum cofactor sulfurase，MCSU）［9，10］可能是關(guān)鍵調(diào)控酶。

Park 等［11］在擬南芥中過表達(dá)AtZEP 基因，在鹽脅迫和旱脅迫條件下轉(zhuǎn)基因植株生長更旺盛，在鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因植株的RD29A 和Rab18 基因的表達(dá)量更高。Iuchi 等［12］在擬南芥中過表達(dá)AtNCED3 基因，增加了內(nèi)源ABA 含量，降低蒸騰速率，增加了轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性。Qin 和Zeevaart［13］將菜豆PvNCED 基因轉(zhuǎn)化煙草，增加了煙草植株的抗旱性。徐春英等［14］將35S 啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型RD29A 啟動(dòng)子以及氣孔特異表達(dá)KST1 啟動(dòng)子與AtNCED3 基因轉(zhuǎn)化煙草，得到了抗旱性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株，其中35S 啟動(dòng)子連接AtNCED3 基因轉(zhuǎn)化煙草，轉(zhuǎn)基因植株生長矮小，發(fā)育滯后；RD29 轉(zhuǎn)基因植株生長比野生型慢一點(diǎn)，而KST1 轉(zhuǎn)基因植株表型最好，在正常條件下生長旺盛。Aswath 等［15］將豇豆VuNCED1 基因轉(zhuǎn)化匍匐剪股穎，鹽和旱脅迫增加了內(nèi)源ABA 的含量，轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫和旱脅迫處理后具有較高的存活率。Wan 等［16］將花生AhNCED1 基因轉(zhuǎn)化擬南芥增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株的ABA含量和耐旱性。賈娟娟等［17］將誘導(dǎo)型啟動(dòng)子rd29A和AtNCED3 基因轉(zhuǎn)化水稻，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因水稻的抗旱性。Zhang 等［18］將SgNCED1 基因轉(zhuǎn)化煙草，發(fā)現(xiàn)降低了轉(zhuǎn)基因植株的氣孔導(dǎo)度，蒸騰速率，增強(qiáng)了其抗氧化酶活性，增加了其H2O2和NO 濃度，增強(qiáng)了其耐旱性和耐鹽性。Zhang 等［19］將SgNCED1基因轉(zhuǎn)化煙草增加了轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性和耐鹽性。Hwang［20］將水稻OsNCED3 基因轉(zhuǎn)化擬南芥，增加ABA 的積累，降低水分丟失，推遲種子萌發(fā)，增強(qiáng)了抗旱性。Xiao 等［21］將LOS5 基因與Actin1 啟動(dòng)子和HVA22 脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子連接轉(zhuǎn)化水稻發(fā)現(xiàn)，在大田和PVC 管道旱脅迫條件下，Actin1∶LOS5 和HVA22P：LOS5 轉(zhuǎn)基因植株的相對(duì)產(chǎn)量和穗育性高于對(duì)照。Yue 等［22］將擬南芥LOS5/ABA3 基因轉(zhuǎn)化煙草，在正常條件下，轉(zhuǎn)基因植株離體葉片蒸騰失水率低于對(duì)照，在缺水條件下，與對(duì)照相比轉(zhuǎn)基因植株萎蔫程度更低，保持更高的水含量，具有更好的細(xì)胞膜完整性，積累較多的ABA 和脯氨酸，具有較高的抗氧化物酶（超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶和抗壞血酸過氧化物酶）活性。Yue等［23］在棉花中過表達(dá)擬南芥AtLOS5 基因，該基因編碼的鉬輔因子為醛氧化酶（AAO）所必須，在旱脅迫條件下，增加了轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)的ABA 和脯氨酸含量，增強(qiáng)了旱反應(yīng)基因P5CS 和RD22 的表達(dá)，提高了抗氧化脅迫酶的活性和膜的完整性，以及生物產(chǎn)量。Li 等［24］將擬南芥LOS5/ABA3 基因轉(zhuǎn)化大豆發(fā)現(xiàn)，在干旱條件下增加了AAO 活性和ABA 的積累，降低氣孔大小和蒸騰速率，減小葉片萎蔫，維持較高的水含量，通過降低電解質(zhì)滲出率和MDA含量減小了細(xì)胞膜的損害，促進(jìn)脯氨酸積累，增加了抗氧化酶活性，增強(qiáng)脅迫相關(guān)基因表達(dá)，增加了大田干旱條件下籽粒產(chǎn)量。Lu 等［25］在玉米中過表達(dá)擬南芥LOS5 基因，增加ZmAO 和AO 活性，增加ABA 的積累，減少水分丟失，維持較高的水含量和葉片水勢(shì)，在干旱條件下，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出較低的葉片萎蔫度，較低的電解質(zhì)滲出率，較低的MDA和H2O2含量，較高的抗氧化酶活性和脯氨酸含量，同時(shí)，也增加了脅迫調(diào)控基因的表達(dá)，復(fù)水后增加根的生物產(chǎn)量（表1）。

3 ABA 信號(hào)通路相關(guān)基因的基因工程

ABA 通過與受體結(jié)合發(fā)揮作用。在擬南芥中，PYR/PYL/RCARs，蛋白磷酸酶2C（protein phosphatase type-2c，PP2Cs）和SNF1 相關(guān)蛋白激酶2（Suc-rose non-fermenting 1-related protein kinase 2，SnRK2s）3 個(gè)蛋白家族組成ABA 的核心信號(hào)模式［26］。PYR/PYL/RCARs 是ABA 受體，PP2Cs 是信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控者，SnRK2s 是下游信號(hào)的正調(diào)控者［27，28］。PP2Cs抑 制SnRK2s 活 性，ABA 與PYR/PYL/RCARs 結(jié)合抑制PP2Cs 的活性，進(jìn)而SnRK2s 的活性增強(qiáng)，SnRK2s 活性增強(qiáng)可以磷酸化下游bZIP 轉(zhuǎn)錄因子［29］。

表1 ABA 相關(guān)基因與抗旱基因工程

Saavedra 等［30］研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PYL8/RCAR3 基因?qū)е聰M南芥種子對(duì)ABA 超敏感，增強(qiáng)了種子的休眠，在低濃度的甘露醇、NaCl 或多效唑處理下不能正常萌發(fā)，在植物組織中，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)耐旱反應(yīng)和早期根生長的抑制，35S∶FsPP2C1 轉(zhuǎn)基因植株中出現(xiàn)相反的表型，說明PYL8/RCAR3 在萌發(fā)和非生物脅迫反應(yīng)中起正調(diào)控作用。Zhang 等［31］將黃花蒿AaPYL9 基因轉(zhuǎn)化黃花蒿增強(qiáng)了其抗旱性和ABA處理后青蒿素的含量。Liu 等［32］將玉米ZmPP2C基因轉(zhuǎn)化擬南芥，降低了植物對(duì)鹽脅迫和旱脅迫的抗性，表現(xiàn)為較低的凈光合速率和脯氨酸含量，較高的MDA 水平和相對(duì)膜透性，脅迫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平下降，對(duì)ABA 不敏感。Umezawa 等［33］將一個(gè)SnRK2 基因SRK2C 轉(zhuǎn)化擬南芥發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)了一系列脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性。Xu 等［34］將小麥中SnRK2 家族的一個(gè)成員W55a 轉(zhuǎn)化擬南芥增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性。Mao 等［35］將小麥TaSnRK2.4 基因轉(zhuǎn)化擬南芥，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株在正常條件下幼苗推遲發(fā)育，有較長的初生根，有較高的產(chǎn)量；具有較強(qiáng)的耐旱性、耐鹽性、耐冷性，表現(xiàn)為降低水分丟失，增強(qiáng)相對(duì)水含量和膜的穩(wěn)定性，增強(qiáng)光合勢(shì)，顯著增強(qiáng)滲透勢(shì)。Zhang 等［36］將小麥的SnRK2 家族的一個(gè)成員TaSnRK2.8 轉(zhuǎn)化擬南芥，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性、耐鹽性及耐冷性，表現(xiàn)為脅迫下轉(zhuǎn)基因植株具有較長的初生根，較高的相對(duì)含水量，更強(qiáng)的細(xì)胞膜穩(wěn)定性，顯著更低的滲透勢(shì)，更多的葉綠素含量，增強(qiáng)的PSII 活性。Ying 等［37］發(fā)現(xiàn)玉米中SnRK2 家族的一個(gè)成員ZmSAPK8 在玉米植株的很多器官中表達(dá)并且在高鹽和干旱處理被上調(diào)表達(dá)，轉(zhuǎn)化擬南芥發(fā)現(xiàn)可以顯著增強(qiáng)抗鹽性，在鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株具有更高的萌發(fā)率和脯氨酸含量，并且未發(fā)現(xiàn)生長異常的轉(zhuǎn)基因植株。Zou 等［38］將玉米中SnRK2 家族的一個(gè)成員ZmSPK1 轉(zhuǎn)化擬南芥發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因植株生長較好，有較高的幼苗鮮重和干重，脯氨酸含量以及SOD 活性，有較低的MDA 含量和較低的相對(duì)電導(dǎo)率，增強(qiáng)了其耐鹽性。Du 等［39］將小麥SnRK2 基因——TaSRK2C1 轉(zhuǎn)化煙草，發(fā)現(xiàn)上調(diào)了調(diào)控因子RD29a、DREB1A 和DREB2 的表達(dá)，增加了自由脯氨酸和可溶性碳水化合物的含量，增強(qiáng)了對(duì)鹽脅迫、脫水脅迫和低溫脅迫的抗性。Tian 等［40］發(fā)現(xiàn)將小麥TaSnRK2 基因轉(zhuǎn)化擬南芥促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因植株根系的發(fā)育，增強(qiáng)了對(duì)干旱脅迫、鹽脅迫、冷脅迫的抗性，增加了非生物脅迫相應(yīng)基因的表達(dá)，改善了生理指標(biāo)，包括降低水分丟失，增加細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，提高光合勢(shì)，顯著增強(qiáng)滲透勢(shì)和游離脯氨酸含量。

目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多ABA 調(diào)節(jié)基因表達(dá)的順式作用元件（ABA-responsive element，ABRE），以及與這些順式作用元件相互作用的轉(zhuǎn)錄因子［41，42］。ABFs（ABRE binding factors）是最近發(fā)現(xiàn)的一種ABRE 結(jié)合bZIP 蛋白［43，44］。過表達(dá)ABF 家族的成員——ABF2［45］、ABF3［46-51］、ABF4［52］、PtrABF［53］、SIAREB1［54］、Wabi5［55］和GmbZIP1［56］增強(qiáng)了擬南芥、萵苣、水稻、番茄、匍匐剪股穎和煙草的抗旱性。

4 展望

目前，ABA 相關(guān)抗旱基因工程已取得一定的成績，但同時(shí)存在一些問題。具體的問題和主要對(duì)策有：（1）目前克隆出的ABA 合成和信號(hào)通路的基因有限，今后需要克隆更多的基因用于植物抗旱基因工程；（2）目前植物抗旱基因工程多為單基因轉(zhuǎn)化，而植物的抗旱性是多基因共同作用的數(shù)量性狀，因此多基因轉(zhuǎn)化能更顯著地提高作物的抗旱性；（3）35S 啟動(dòng)子和目的基因轉(zhuǎn)化植物常常產(chǎn)生畸形植株，將脅迫誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子、根特異表達(dá)啟動(dòng)子等連接抗旱基因轉(zhuǎn)化植物可以避免畸形植株的產(chǎn)生，減少能量消耗；（4）目前基因工程抗旱性鑒定多為溫室和實(shí)驗(yàn)室條件下的鑒定，而轉(zhuǎn)基因作物應(yīng)用于生產(chǎn)是在大田自然干旱條件下，因此今后需要進(jìn)行轉(zhuǎn)基因作物大田自然干旱條件下的抗旱性鑒定，同時(shí)植物的抗旱性最終表現(xiàn)在產(chǎn)量上，因此需要對(duì)產(chǎn)量指標(biāo)進(jìn)行鑒定。

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