亞麻SRAP標(biāo)記連鎖圖譜的構(gòu)建及3個(gè)數(shù)量性狀的定位

李明，姜碩，鄭東澤，楊勇

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

亞麻SRAP標(biāo)記連鎖圖譜的構(gòu)建及3個(gè)數(shù)量性狀的定位

李明，姜碩，鄭東澤，楊勇

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

以早熟、蒴果開裂、藍(lán)花的典型種用農(nóng)家種CN100910與中晚熟、白花、高纖的典型纖用亞麻Opaline雜交得到的F2群體作為構(gòu)圖群體，從513對(duì)SRAP引物中成功獲得63對(duì)條帶清晰、多態(tài)性好的引物，共產(chǎn)生249個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。其中169個(gè)位點(diǎn)構(gòu)成含有18個(gè)連鎖群，全長499.30 cM的亞麻連鎖圖，標(biāo)記的平均圖距為2.95 cM。其中較長的連鎖群為L16，全長120.3 cM，有34個(gè)點(diǎn)被標(biāo)記在連鎖群上。最短的連鎖群L9只有0.1 cM，僅兩個(gè)位點(diǎn)被標(biāo)記其上。在圖譜上檢測(cè)到與纖維含量、工藝長度和裂果性狀有關(guān)的15個(gè)QTL。

亞麻；SRAP；連鎖圖譜

亞麻（Linum usitatissimum）是亞麻屬一年生草本植物，在北溫帶地區(qū)分布很廣，是在種植歷史早期就已出現(xiàn)的古老韌皮纖維作物和油料作物[1]。近年來，分子標(biāo)記技術(shù)在作物染色體連鎖圖譜構(gòu)建上得到廣泛應(yīng)用，作物遺傳圖譜的發(fā)表數(shù)量每年都在穩(wěn)步增加。亞麻作為重要的經(jīng)濟(jì)作物，關(guān)于其遺傳圖譜的報(bào)道極少，只有國外的幾張圖譜[1-4]，國內(nèi)尚未見報(bào)道。

現(xiàn)有圖譜及其QTL信息并不能滿足育種工作需求，急需在原基礎(chǔ)上加大圖譜的密度和長度，并找到更多性狀的QTL。SRAP（Sequence-related amplification polymorphism）是一種基于PCR的分子標(biāo)記系統(tǒng)，具有操作簡便迅速、成本低、可靠性好、重復(fù)性高的優(yōu)點(diǎn)，可克服RAPD重復(fù)性差A(yù)FLP技術(shù)復(fù)雜、成本昂貴的缺點(diǎn)[5]。本研究選用油用農(nóng)家種CN100910與纖用亞麻Opaline雜交得到的F2群體作為構(gòu)圖群體，利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)，構(gòu)建亞麻連鎖圖并定位部分性狀QTL，分析性狀遺傳規(guī)律，可為基因克隆和分子輔助育種研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 作圖群體構(gòu)建

以O(shè)paline作為母本，CN100910作為父本進(jìn)行雜交得到F2代96個(gè)單株作為構(gòu)建圖譜的群體材料。Opaline是一種纖維含量較高的典型纖維亞麻品種，白花、種子千粒重較低、抗病性稍差，熟期中等。CN100910是一種具有蒴果開裂特點(diǎn)的典型種用農(nóng)家種，藍(lán)花、初花日數(shù)早、花期長、花枝較多，種子千粒重一般，熟期早熟。

1.2 農(nóng)藝性狀調(diào)查和統(tǒng)計(jì)

在后代群體收獲后，調(diào)查其纖維含量、工藝長度及蒴果開裂情況，作為QTL分析的數(shù)據(jù)。

1.3 亞麻總DNA提取和檢測(cè)

選取鮮嫩莖葉為材料，利用改良的CTAB法[6]提取親本和作圖群體的總DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量，以DL2000 Marker為參照檢測(cè)DNA濃度。

1.4 SRAP引物篩選

根據(jù)Li和Quiros等報(bào)道[7]，選用曾在黃麻中使用的SRAP引物[8]，上游引物19個(gè)（見表1），下游引物27個(gè)（見表2），由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

利用親本的模板DNA對(duì)513對(duì)引物進(jìn)行比對(duì)篩選，結(jié)果用6%變性聚丙烯凝膠電泳檢測(cè)。初步篩選后，將多態(tài)性好的引物進(jìn)行再次篩選。

表1 正向引物名稱及引物序列Table 1 Name of the forward primer and primer sequences

SRAP-PCR擴(kuò)增程序選用本研究室優(yōu)化后的擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性10 s，35℃復(fù)性20 s，72℃延伸1 min，重復(fù)循環(huán)4次；94℃變性10 s，54.5℃復(fù)性20 s，72℃延伸1 min，重復(fù)循環(huán)38次；72℃延伸7 min后4℃終止并保存[9]。

1.5 數(shù)據(jù)分析和處理

首先分析引物的多態(tài)性及特異位點(diǎn)來源（來源于父本或母本）；其次對(duì)多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行命名。根據(jù)“上游引物+下游引物”+“條帶順序號(hào)”的方式為多態(tài)性標(biāo)記命名，例如：上游引物Me1與下游引物Em1組合，電泳結(jié)果中總條帶的第4條帶為特異條帶時(shí)，則此位點(diǎn)記錄為“m1e1-4”。針對(duì)一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，后代群體中該特異位點(diǎn)與父本CN100910相同的記作“a”，與母本Opaline相同的記作“b”，條帶不清晰或結(jié)果缺失的記作“-”。

1.6 連鎖圖譜構(gòu)建及QTL分析

選用Mapmaker/EXP 3.0軟件進(jìn)行連鎖圖譜的繪制。首先用sequence和group（LOD≥3）命令找出所有的可能子集，根據(jù)子集個(gè)數(shù)確定連鎖群數(shù)目。用make chromosome命令設(shè)定連鎖群LX（X= 1，2，3……），用sequence和anchor命令將子集中的標(biāo)記瞄定到連鎖群上，用sequence和assign命令對(duì)所有標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析，用attch命令將可能分配到兩個(gè)不同連鎖群上的標(biāo)記分配到LOD值較大的連鎖群上，最后用framework命令計(jì)算每個(gè)連鎖群的遺傳圖距。通過WinQTLCart2.5軟件運(yùn)算遺傳圖距，用DrawChr按鍵繪制連鎖圖譜，并分析QTL信息，用畫圖軟件將其標(biāo)記到遺傳圖譜上。

表2 反向引物及引物序列Table 2 Name of reverse primer and primer sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 SRAP分析

從513對(duì)引物中得到63對(duì)多態(tài)性好的引物組合，共擴(kuò)增出條帶842條，其中特異條帶249條，占總條帶數(shù)的29.57%。引物擴(kuò)增的條帶從3～28條不等，特異條帶1～13條不等。在所有引物中，特異條帶比率最低的是Me19Em19，僅為5.56%。特異條帶比率最高的為Me7Em20，其特異性比率達(dá)76.47%，在所有特異性標(biāo)記中，來自父本的標(biāo)記數(shù)163個(gè)，占總特異性條帶65.46%；來自母本的標(biāo)記數(shù)86個(gè)，占總特異性條帶的34.54%（見表3）。圖1是引物對(duì)Me4Em10在親本和F2群體中的擴(kuò)增結(jié)果。

表3 最終篩選出的引物名稱及其擴(kuò)增條帶Table 3 Primers screened and it's bands

引物名稱Primer ID M5E14 M5E26 M10E17 M10E13 M6E1 M6E5 M10E18 M11E4 M6E8 M6E26 M6E27 M7E9 M7E10 M7E18 M7E20 M8E10 M10E21 M11E18 M7E26 M15E8 M12E14 M8E5條帶來源Band origin父本Male總條帶Total bands 10 16 13 10 16 16母本Female特異條帶Special band多態(tài)性（%）Polymorphism總條帶Total bands 15 28 15 16 17 7 10 13 12 17 21 12 11 10條帶來源Band origin父本Male母本Female特異條帶Special band多態(tài)性（%）Polymorphism 9 4 1 7 13 12 17 9 17 17 12 11 12 11 11 11 9 2 4 1 2 3 1 1 0 3 3 1 9 4 4 9 2 4 2 3 0 2 1 0 1 1 0 2 3 0 1 2 1 3 1 1 3 4 3 0 1 1 2 1 1 2 5 2 2 5 4 1 1 5 4 4 1 0 5 7 1 3 5 4 3 4 2 3 2 20.00 31.25 15.38 20.00 31.25 25.00 11.11 25.00 29.41 30.77 33.33 58.82 55.56 41.18 76.47 41.67 36.36 25.00 36.36 18.18 27.27 22.22引物名稱Primer ID M15E24 M12E25 M14E6 M6E3 M15E25 M14E3 M16E12 M17E1 M15E4 M15E5 M16E24 M16E3 M16E15 M7E8 M19E8 M16E27 M14E7 M5E3 M18E3 M19E13 M19E19 8 8 1 3 8 1 8 14 18 1 2 0 1 1 1 3 4 3 3 5 3 3 2 2 3 3 1 1 2 1 1 3 2 2 1 1 1 1 2 2 1 1 1 0 0 0 3 0 2 1 0 2 5 2 3 2 2 4 5 5 5 6 4 4 2 2 3 6 1 3 3 1 13.33 17.86 13.33 18.75 11.76 28.57 40.00 38.46 41.67 29.41 28.57 33.33 36.36 20.00 25.00 37.50 46.15 12.50 16.67 21.43 5.56

圖1 引物對(duì)Me4Em10在親本和F2群體中的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Primer Me4Em10 amplification results in the parents an F2population

2.2 連鎖圖譜構(gòu)建及QTL分析

利用Mapmaker/Exp 3.0b和WinQTLCart 2.5軟件構(gòu)建一張包含18個(gè)連鎖群、共169個(gè)位點(diǎn)的亞麻連鎖圖譜。所有連鎖群中，圖距最長的連鎖群是L16，包括34個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，總長120.30 cM，平均圖距3.54 cM，圖距最短的連鎖群是L9，包括兩個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，兩標(biāo)記間圖距0.1 cM。所有的連鎖群上，標(biāo)記間最短距離為0.10 cM，最長距離43.1 cM。連鎖圖總長499.30 cM，平均圖距約為2.95 cM（見圖2）。

圖譜中偏分離位點(diǎn)80個(gè)，比率為47.3%。在這張連鎖圖譜上，除L1、L2、L5、L8、L10、L11、L12、L18外，其他8個(gè)連鎖群都有偏分離標(biāo)記存在（見表4）。

LOD≥2.5的條件下，與纖維含量有關(guān)的4個(gè)QTL分布在第2、17連鎖群上，分布在第17連鎖群上的3個(gè)位點(diǎn)都具有加性效應(yīng)且都是主效基因，分布在第2連鎖群上的位點(diǎn)具有負(fù)加性效應(yīng)，是1個(gè)微效基因。貢獻(xiàn)率分別21.93%、20.32%、23.35%和0.64%；與工藝長度有關(guān)的4個(gè)QTL中3個(gè)分布在第17連鎖群上，貢獻(xiàn)率分別31.48%、23.23%、23.56%，1個(gè)分布在18連鎖群上，具有負(fù)加性效應(yīng)，貢獻(xiàn)率為0.84%，因此連鎖群17與亞麻的纖維發(fā)育和纖維產(chǎn)量有密切關(guān)系，是重要1個(gè)連鎖群。與裂果有關(guān)的7個(gè)QTL分布在第4、15、17連鎖群上各有2、2、3個(gè)，貢獻(xiàn)率分別為0.60%、0.12%、16.15%、0.28%、53.02%、6.67%和56.83%，也以第17連鎖群上的貢獻(xiàn)率較大。

圖2 基于SRAP技術(shù)構(gòu)建的亞麻連鎖圖譜Fig.2 Flax linkage map based on SRAP marker technique

表4 SRAP標(biāo)記在連鎖圖譜上的分布Table 4 Distribution of SRAP markers on the linkage map

3 討論與結(jié)論

相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（Sequence-related amplified polymorphism，SRAP）是基于PCR技術(shù)的新型分子標(biāo)記技術(shù)，被廣泛應(yīng)用在植物遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、重要標(biāo)記定位、遺傳多樣性分析和雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)。本研究結(jié)果表明SRAP標(biāo)記多態(tài)性較高、操作簡便、條帶易于分離，適合于構(gòu)建亞麻連鎖圖譜。

Sprelmeyer等利用AFLP標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建了第一張亞麻的遺傳連鎖圖，圖譜包括18個(gè)連鎖群，覆蓋基因組長度1 400 cM，因其群體構(gòu)建基于亞麻枯萎病研究，有助于抗枯萎病基因的遺傳定位[2]。Oh等應(yīng)用RFLP與RAPD標(biāo)記構(gòu)建亞麻分子遺傳圖譜，圖譜包括15個(gè)連鎖群，共94個(gè)標(biāo)記，覆蓋基因組長度約1 000 cM[3]。Vromans利用AFLP技術(shù)繪制一張含有502個(gè)標(biāo)記、共18個(gè)連鎖群、覆蓋基因組1 296 cM的遺傳圖譜，找到與12個(gè)性狀有關(guān)的73個(gè)QTL[1]。Cloutier等利用新開發(fā)的EST-SSR構(gòu)建一張含有24個(gè)連鎖群、共113個(gè)標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜，覆蓋基因組長度833.8 cM，定位與亞麻脂肪酸成分有關(guān)的3個(gè)性狀的QTL[4]。

本研究選用的兩個(gè)親本農(nóng)藝性狀差異極大，其中農(nóng)家種CN100910接近野生，開花早，植株矮小，纖維含量低，蒴果開裂，種子產(chǎn)量較高，抗病性好。而Opalina是典型的高纖品種，抗病性稍差。二者后代多態(tài)性好，是理想的作圖群體。在亞麻分子標(biāo)記的應(yīng)用上首次采用SRAP技術(shù)，得到一張含有18個(gè)連鎖群，共169個(gè)位點(diǎn)，全長499.30 cM的亞麻連鎖圖，標(biāo)記的平均圖距為2.95 cM。其中較長的連鎖群為L16，全長120.3 cM，有34個(gè)點(diǎn)被標(biāo)記在連鎖群上。最短的連鎖群L9只有0.1 cM，僅兩個(gè)位點(diǎn)被標(biāo)記其上。與前人研究結(jié)果相比，圖譜覆蓋稍少，可能與試驗(yàn)所用F2群體數(shù)量較少及引物對(duì)數(shù)量少有關(guān)。亞麻遺傳圖譜的研究較少，現(xiàn)有的幾個(gè)連鎖圖譜都只反映亞麻基因組的局部，需要進(jìn)一步開展相關(guān)研究加以豐富。雖然本試驗(yàn)構(gòu)造的圖譜覆蓋長度不長，但由于材料和分子標(biāo)記的不同，可補(bǔ)充前人研究圖譜中錯(cuò)過的連鎖群或染色體區(qū)域。

偏分離不遵循分離規(guī)律，無法用傳統(tǒng)的遺傳理論和方法加以分析[10]。不同作物與不同分子標(biāo)記所產(chǎn)生的偏分離現(xiàn)象也有所不同，李愛賢等利用SRAP標(biāo)記技術(shù)繪制甘薯遺傳圖譜所統(tǒng)計(jì)1 199個(gè)標(biāo)記中，有561個(gè)標(biāo)記表現(xiàn)偏分離，頻率46.8%[11]。王建設(shè)等利用同樣的技術(shù)對(duì)中國香瓜和哈密瓜后代群體作圖時(shí)僅在187個(gè)標(biāo)記中發(fā)現(xiàn)8個(gè)偏分離標(biāo)記[12]。本研究利用SRAP技術(shù)繪制亞麻連鎖圖譜得到的偏分離比率為47.3%，偏分離比率較高，可能與親本間差異較大遺傳距離較遠(yuǎn)有關(guān)。

LOD值是一個(gè)變量，表明主要和次要的QTL，主要的QTL可以解釋高表型變異，次要QTL在選擇性育種中發(fā)揮的作用也極其重要[13]。本試驗(yàn)選擇LOD≥2.5既可以找到一些遺傳效應(yīng)較高的QTL，也可以找到一些遺傳效應(yīng)小的QTL。在LOD≥2.5時(shí)，即檢測(cè)到與纖維含量、工藝長度和裂果性狀有關(guān)的主效基因，也檢測(cè)到與其相關(guān)的微效基因。其中與纖維含量有關(guān)的4個(gè)QTL中有3個(gè)為主效基因，最大貢獻(xiàn)率為23.35%；檢測(cè)到與工藝長度有關(guān)的4個(gè)QTL，最大貢獻(xiàn)率達(dá)31.48%；裂果性狀接近野生亞麻，本研究找到與裂果有關(guān)的7個(gè)QTL，最大的可以解釋56.83%表型變異。3個(gè)性狀的主要QTL都集中在連鎖群17上，與相關(guān)性狀進(jìn)化有密切聯(lián)系。

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LI Ming,JIANG Shuo,ZHENG Dongze, YANG Yong(School of Agriculture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

CN100910 that was typically landrace with traits of early mature,blue flower and dehiscent capsular and Opaline that was typically fiber variety with mid-late mature,white flower and high-fiber content were used as parents to construct a population of F2generation including 96 individual plants.A total of 513 sequence-related amplified polymorphisms(SRAP)primer pairs were used to screen the polymorphism of the parents,and obtained 63 primer pairs which produced 249 poly-morphological loci.A genetic linkage map consists of 18 linkage groups and covers 499.30 cM with an average genetic distance of 2.95 cM was constructed using 169 SRAP loci.Group 16 was the longest with distance of 120.3 cM,and contained 34 markers.Group 9 was the shortest with distance of 0.1 cM,and contained two markers.15 QTLs related to fiber content,the technical length and capsule dehiscent were detected on the map.

flax;SRAP;linkage map

S435

A

1005-9369（2014）02-0012-07

2012-10-19

哈爾濱市科技局科技創(chuàng)新項(xiàng)目（2009RFLXN015）

李明（1964-），男，研究員，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樽魑锷砼c分子技術(shù)。E-mail:liming@neau.edu.cn

時(shí)間2014-1-17 16:42:16[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140117.1642.018.html

李明,姜碩,鄭東澤,等.亞麻SRAP標(biāo)記連鎖圖譜的構(gòu)建及3個(gè)數(shù)量性狀的定位[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(2):12-18.

Li Ming,Jiang Shuo,Zheng Dongze,et al.Construction of linkage map based on SRAP marker and mapping of three traits inLinum usitiatissimumL.[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(2):12-18.(in Chinese with English abstract)

Construction of linkage map based on SRAP marker and mapping of three traits inLinum usitiatissimumL.