SND1對奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響

高學(xué)軍，司雨，張霞，黃玉玲，曲波，李慶章

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

SND1對奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響

高學(xué)軍，司雨，張霞，黃玉玲，曲波，李慶章

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

SND1（p100）作為轉(zhuǎn)錄共激活子，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子5（STAT5）中起重要作用，已在牛以外的其他物種中報(bào)道SND1與STAT5相互作用激活STAT5基因介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄。試驗(yàn)為驗(yàn)證SND1對奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期影響，構(gòu)建SND1表達(dá)載體及si RNA轉(zhuǎn)染奶牛乳腺上皮細(xì)胞，用CASY法檢測細(xì)胞活力及增殖能力，用流式細(xì)胞儀檢測奶牛乳腺上皮細(xì)胞周期，Western Blot確定SND1轉(zhuǎn)染奶牛乳腺上皮細(xì)胞功能。結(jié)果表明，SND1對于奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖屬于正調(diào)控因子，SND1與STAT5相互作用影響CyclinD1表達(dá)，SND1通過CyclinD1途徑促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)行。

SND1；奶牛乳腺上皮細(xì)胞；過表達(dá)；RNA干擾；細(xì)胞增殖

SND1最初作為EBNA2（Epstein-Barr virus nu?clear protein 2，EB病毒細(xì)胞核抗原2）轉(zhuǎn)錄共激活因子蛋白被發(fā)現(xiàn)[1]。SND1（Tudor-SN，p100）是一種進(jìn)化上高度保守且分布廣泛的蛋白質(zhì)，已發(fā)現(xiàn)其在人、牛、大鼠、小鼠、嗜熱四膜蟲、水稻、擬南芥等不同物種中均廣泛存在。SND1是多功能蛋白，可以與轉(zhuǎn)錄相互作用并廣泛調(diào)節(jié)涉及轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)，例如EBNA-2活化基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄[2]。除結(jié)合EBNA-2的酸性激活域，曾有報(bào)道證實(shí)SND1蛋白可作為轉(zhuǎn)錄共激活因子與STAT5-TAD區(qū)域結(jié)合，參與調(diào)控JAK2-STAT5信號通路[3]。JAK-STAT信號通路是近年發(fā)現(xiàn)的一條由細(xì)胞因子刺激的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等重要生物學(xué)過程[4]。研究發(fā)現(xiàn)在小鼠細(xì)胞內(nèi)干擾SND1蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞的增殖能力，使細(xì)胞周期停滯于Gl期，超表達(dá)SND1蛋白卻發(fā)現(xiàn)其能加快細(xì)胞周期進(jìn)程，表明SND1蛋白參與細(xì)胞周期調(diào)控過程，并在Gl期發(fā)揮重要作用[5]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

正常培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞系[6]。

1.1.2 主要試劑

胰島素、催乳素（購自Sigma公司）；優(yōu)質(zhì)胎牛血清、DF12培養(yǎng)基（購自Gibco公司）；STAT5、p-STAT5、β-actin一抗（購自Santa Cruz公司）；SND1（購自Abcam公司）；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗、HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG二抗（購自北京中杉公司）；ECL超敏發(fā)光液（購自普利萊生物公司）；根據(jù)SND1基因序列設(shè)計(jì)合成的siRNA oligos、陰性對照siRNA（購自上海吉瑪公司）；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、Trizol試劑（購自Invitrogen公司）；CASY-ton緩沖液其他常規(guī)藥品和試劑均為國產(chǎn)。

1.1.3 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱（日本CO-150型），DFC280倒置相差顯微鏡（德國LEICA），ABI PRISM 7300 RTPCR系統(tǒng)（美國Applied Biosystems公司），流式細(xì)胞儀（美國Becton Dicknson公司），CASY細(xì)胞活力分析儀（德國Roche公司）；其他儀器均為國產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 RNA干擾轉(zhuǎn)染

選擇對數(shù)生長期的荷斯坦牛乳腺上皮細(xì)胞，傳代到6孔培養(yǎng)板中增長過夜，待轉(zhuǎn)染的各孔細(xì)胞中，分別加入1 μg DNA和2 μL脂質(zhì)體2000（LF2000）稀釋到200 mL無血清培養(yǎng)基中，脂質(zhì)體2000一旦稀釋與DNA在室溫下孵育20 min，使形成的DNA-LF2000絡(luò)合物，然后直接加入到各孔中。細(xì)胞在37℃下培養(yǎng)24 h，然后收集用于進(jìn)一步的試驗(yàn)。

1.2.2 pGCMV-IRES-EGFP-SND1構(gòu)建和轉(zhuǎn)染

SND1全長片段通過PCR擴(kuò)增，并與特定的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)結(jié)合而設(shè)計(jì)的引物如下。上游引物：5′GAAGATCTATGGCCTCCTCCGCGCAGAGC 3′（BglⅡ），下游引物：5′GCGTCGACTGGAAGGAG AGGGCAGGTC3′（Sal I）。PCR片段連接到TA克隆載體（Promega公司）并完全測序，全長的SND1由Bgl II和Sal I剪切，然后連接到pGCMV-IRESEGFP載體。所有結(jié)構(gòu)進(jìn)行測序驗(yàn)證。待轉(zhuǎn)染的各孔細(xì)胞中，分別加入1 μg DNA和2.5 μL脂質(zhì)體2000（LF2000）稀釋到200 mL無血清培養(yǎng)基中，脂質(zhì)體2000一旦稀釋與DNA在室溫下孵育20 min，使形成的DNA-LF2000絡(luò)合物，然后直接加入到各孔中。細(xì)胞在37℃下培養(yǎng)24 h，然后收集用于進(jìn)一步的試驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞活力及增殖能力的檢測

利用胰蛋白酶消化各組細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，取100 μL加入到10 mL CASY-ton緩沖液中稀釋搖勻，取200 μL進(jìn)行檢測，做3次平行，采用CASY細(xì)胞活力分析儀測定細(xì)胞活力和增殖能力。

1.2.4 細(xì)胞周期的測定

取轉(zhuǎn)染24 h后6孔板中的細(xì)胞，消化成單細(xì)胞懸液，用PBS洗滌800 r·min-1離心5～10 min，用預(yù)冷的70%酒精與PBS按7:3的比例固定過夜，PBS再洗滌800 r·min-1離心5～10 min，加PI染料50 μg·mL-1，待上機(jī)測定。

1.2.5 Western blotting分析

用細(xì)胞裂解液提取轉(zhuǎn)染24 h的細(xì)胞總蛋白。β-actin作為內(nèi)參，Western Blotting條件：10% SDS-PAGE，一抗比例1∶1 000，二抗比例1∶5 000稀釋，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

應(yīng)用SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析，所有結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，所有試驗(yàn)重復(fù)3次。P＜0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著，P＜0.01為差異極其顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)染siRNA及表達(dá)載體對細(xì)胞增殖及周期分布的影響

通過RNA干擾技術(shù)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)實(shí)現(xiàn)SND1的抑制和過表達(dá)后，采用CASY法檢測不同組間奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖情況。奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期分布如圖1所示，轉(zhuǎn)染siRNA對奶牛乳腺上皮細(xì)胞的活力及增殖能力具有抑制作用（見圖1A、1B）；轉(zhuǎn)染pGCMV-IRES-EGFP-SND1對奶牛乳腺上皮細(xì)胞的活力及增殖能力具有促進(jìn)作用（見圖1C、1D）。通過流式細(xì)胞儀檢測不同組間奶牛乳腺上皮細(xì)胞的周期分布情況，觀察SND1對細(xì)胞周期分布的影響。試驗(yàn)結(jié)果如圖1E所示，轉(zhuǎn)染siRNA下調(diào)SND1的表達(dá)水平時(shí)，G1期細(xì)胞比例增加，S期和M期細(xì)胞比例降低，細(xì)胞增殖指數(shù)顯著降低；轉(zhuǎn)染pGCMV-IRES-EGFP-SND1質(zhì)粒上調(diào)SND1表達(dá)水平時(shí)，Gl期細(xì)胞比例降低，而S期和M期細(xì)胞比例增加，細(xì)胞增殖指數(shù)顯著升高（見圖1F）。

圖1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期分布Fig.1 Dairy cow mammary epithelial cells proliferation and cell cycle distribution

2.2 干擾SND1下調(diào)增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)

轉(zhuǎn)染siRNA抑制SND1的表達(dá)，在乳腺上皮細(xì)胞中用Western blotting檢測相關(guān)增殖基因表達(dá)。與對照組比較，SND1抑制組SND1蛋白表達(dá)明顯下降（50%～55%）。在乳腺上皮細(xì)胞增殖中，CyclinD1是關(guān)鍵因子。Western blotting結(jié)果顯示，CyclinD1的表達(dá)水平降低。與對照組比較，SND1抑制組STAT5，p-STAT5蛋白表達(dá)水平都有明顯的降低。

2.3 過表達(dá)SND1上調(diào)增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)

為驗(yàn)證SND1影響增殖相關(guān)基因的表達(dá)，過表達(dá)SND1時(shí)，在乳腺上皮細(xì)胞中用Western blotting檢測增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)。Western blotting結(jié)果顯示，SND1增加CyclinD1蛋白的表達(dá)，SND1上調(diào)STAT5，p-STAT5蛋白表達(dá)，這些數(shù)據(jù)表明SND1可能通過p-STAT5和CyclinD1調(diào)控乳腺上皮細(xì)胞增殖（見圖3）。

圖2 干擾SND1抑制增殖相關(guān)蛋白Western blotting結(jié)果（A）及蛋白表達(dá)灰度掃描值（B）Fig.2 Interference SND1 inhibit proliferation related proteins Western blotting results（A）and protein expression gray scanning value（B）

圖3 過表達(dá)SND1上調(diào)增殖相關(guān)蛋白Western blotting結(jié)果（A）及蛋白表達(dá)灰度掃描值（B）Fig.3 Overexpression of SND1 increase proliferation related proteins Western blotting results（A）and protein expression gray scanning value（B）

3 討論與結(jié)論

SND1在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有多種生物作用，包括轉(zhuǎn)錄，mRNA加工，mRNA剪接，RNAi誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC）形成等[7]。本試驗(yàn)SND1過表達(dá)和干擾影響CyclinD1和p-STAT5表達(dá)。STAT5能夠影響細(xì)胞的增殖、分化、存活與凋亡，在乳腺發(fā)育、免疫應(yīng)答、干細(xì)胞自我更新調(diào)控、造血作用以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等中具有重要作用[8]。SND1作為轉(zhuǎn)錄共激活因子與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，包括STAT5，STAT6，c-Myb，Pim-1。STAT5在細(xì)胞質(zhì)中是無活性物質(zhì)，磷酸化使其激活，在乳腺中STAT5參與細(xì)胞增殖[9]。本文證明在乳腺上皮細(xì)胞中SND1參與PRL-Jak2-Stat5途徑調(diào)控細(xì)胞增殖。SND1增加STAT5和p-STAT5的表達(dá)，說明SND1可能與STAT5相互作用調(diào)控細(xì)胞增殖。

流式結(jié)果研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)干擾SND1蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞的增殖能力，使細(xì)胞周期停滯于G1期，細(xì)胞增殖指數(shù)顯著降低；超表達(dá)SND1蛋白卻發(fā)現(xiàn)其能夠加快細(xì)胞周期進(jìn)程，表明SND1蛋白參與細(xì)胞周期調(diào)控過程，并在G1期發(fā)揮重要作用，細(xì)胞增殖指數(shù)顯著升高。這與之前報(bào)道小鼠細(xì)胞內(nèi)研究結(jié)果一致[5-10]。STAT5激活反應(yīng)也直接和間接調(diào)節(jié)調(diào)控細(xì)胞周期的CyclinD1蛋白的表達(dá)[11]。SND1控制細(xì)胞周期的進(jìn)程由G1向S期轉(zhuǎn)變。CyclinD1是由G1向S期轉(zhuǎn)變的重要調(diào)節(jié)因子[12]。Western Blotting結(jié)果證實(shí)，在SND1過表達(dá)組，CyclinD1蛋白表達(dá)明顯增長。而SND1抑制組中CyclinD1蛋白表達(dá)顯著減少，SND1與STAT5相互作用影響CyclinD1表達(dá)。可能存在一個(gè)機(jī)制是在乳腺上皮細(xì)胞中，SND1可能會(huì)影響細(xì)胞周期進(jìn)程通過CyclinD1激活。目前有關(guān)SND1蛋白報(bào)道較多[10-12]，大多是人類腫瘤、癌癥等方面的研究，對于奶牛乳腺方面研究較少，局限在SND1作為轉(zhuǎn)錄共激活子調(diào)節(jié)基因表達(dá)等方面，本文對SND1促進(jìn)奶牛乳腺上皮的細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程有新見解。

SND1增加STAT5、p-STAT5和CyclinD1表達(dá)。SND1與STAT5相互作用影響CyclinD1表達(dá)，SND1促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞的增殖通過刺激CyclinD1表達(dá)。

[1]Valineva T,Yang J,Silvennoinen O.Characterization of RNA he?licase A as component of STAT6-dependent enhanceosome[J].Nucleic Acids Res,2006,34(14):3938-3946.

[2]Leverson J D,Koskinen P J,Orrico F C,et al.Pim-1 kinase and p100 cooperate to enhance c-Myb activity[J].Mol Cell,1998,2 (4):417-425.

[3]Paukku K,Yang J,Silvennoinen O.Tudor an d nuclease-like do?mains containing protein p100 function as coactivators for signal transducer and activator of transcription 5[J].Mol Endocrinol,2003,17(9):1805-1814.

[4]陳曉萍,徐飛.JAK-STAT信號通路研究進(jìn)展[J].自然雜志,2003(3):149-152.

[5]Heidebreeht H J,Buek F,Steinmann J,et al.p100:A novel prolif?eration-associated nuclear protein speeifieally restricted to cell cycle phases S,G2,and M[J].Blood,1997,90(1):226-233.

[6]陳建暉,佟慧麗,李慶章,等.奶牛乳腺上皮細(xì)胞系的建立[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2009,40(5):743-747．

[7]Weissbach R,Scadden A D.Tudor-SN and ADAR1 are compo?nents of cytoplasmic stress granules[J].Cold Spring Harbor Labo?ratory Press,2012,18(3):462-471.

[8]張?jiān)娳S,徐亞明,宋一超,等.Stat5:多功能的轉(zhuǎn)錄因子[J].生命的化學(xué),2012(2):38.

[9]史琳琳.奶牛乳腺上皮細(xì)胞JAK2-STAT5和mTOR信號通路協(xié)同調(diào)控乳蛋白合成[D].哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

[10]蘇超.多功能p100蛋白對細(xì)胞周期的調(diào)控機(jī)制研究[D].天津:天津醫(yī)科大學(xué),2011.

[11]Lim E J,Joung Y H,Jung S M,et al.Hemin inhibits cyclinD1 and IGF-1 expression via STAT5b under hypoxia in ERalpha-nega?tive MDA-MB 231 breast cancer cells[J].Int J Oncol,2010,36 (5):1243-1251.

[12]Kusume T,Tsuda H,Kawabata M,et al.The p16-cyclin D1/ CDK4-pRb pathway and clinical outcome in epithelial ovarian cancer[J].Clin Cancer Res,1999,5(12):4152-4157.

SND1 effects on cell proliferation and cycle distribution of dairy cow mammary epithelial cellsin vitro

GAO Xuejun,SI Yu,ZHANG Xia,HUANG Yuling,QU Bo,LI Qingzhang
(Key Laboratory of Dairy Science of Education Ministry,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

SND1(p100)as a co-activator for several transcription factors，plays a vital role in signal transduction and activator of transcription 5(STAT5)，there are reports that SND1 interaction with STAT5 mediates gene transcription.In this study,in order to verify SND1 effects on cell proliferation and cycle distribution of dairy cow mammary epithelial cells(DCMEC),we constructed transfected DCMEC with SND1,the viability and proliferation of DCMEC were measured by CASY method,DCMEC were detected by flow cytometry method.Western blot was used to determine SND1 transfection into DCMEC function.These data demonstrated that SND1 was a positive regulatory factor of DCMEC on proliferation ability,and SND1 interacted with STAT5 which impacted CyclinD1 expression.SND1 could promote cell cycle by CyclinD1 pathway.

SND1;dairy cow mammary epithelial cell;overexpression;RNA interference;cell proliferation

S767.5；X172

A

1005-9369（2014）04-0078-05

2013-11-12

科技部“973”項(xiàng)目（2011CB100804）；科技部“863”項(xiàng)目（2013AA102504-03）

高學(xué)軍（1969-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槊谌樯飳W(xué)與乳業(yè)生物技術(shù)。E-mail:gaoxj5390@sina.com

時(shí)間2014-4-21 13:22:12[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140421.1322.010.html

高學(xué)軍,司雨,張霞,等.SND1對奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(4)∶78-82.

Gao Xuejun,Si Yu,Zhang Xia,et al.SND1 effects on cell proliferation and cycle distribution of dairy cow mammary epithelial cellsin vitro[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(4)∶78-82.(in Chinese with English abstract)