興安白頭翁小孢子發(fā)育與雄配子體形成的研究

全雪麗，金英花，吳松權(quán)，解明星，呂惠子

（1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133000；2.延邊大學(xué)藥學(xué)院，吉林延吉 133000）

興安白頭翁小孢子發(fā)育與雄配子體形成的研究

全雪麗1，金英花1，吳松權(quán)1，解明星1，呂惠子2

（1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133000；2.延邊大學(xué)藥學(xué)院，吉林延吉 133000）

采用常規(guī)石蠟切片法，對興安白頭翁小孢子不同發(fā)育時期的細(xì)胞學(xué)特征以及與花蕾大小的相關(guān)性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，興安白頭翁每朵花內(nèi)包含數(shù)枚雄蕊，每個花藥具有4個花粉囊，小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂屬同時型，小孢子四分體屬四面體型。成熟花粉粒屬2-細(xì)胞型，并有3個萌發(fā)溝。花粉囊壁由4層細(xì)胞構(gòu)成，即表皮、藥室內(nèi)壁、中層、絨氈層。絨氈層發(fā)育屬腺質(zhì)型（或分泌型），出現(xiàn)多核現(xiàn)象。興安白頭翁同一花蕾不同花藥之間，同一花藥不同花粉囊之間小孢子發(fā)育存在不同步性。

興安白頭翁；小孢子；雄配子體；發(fā)育

興安白頭翁[Pulsatilla dahurica（Fisch.）Spreng]是毛茛科白頭翁屬多年生草本植物，主要分布于我國東北地區(qū)。其干燥根可以入藥，具有清熱解毒、涼血止痢、燥濕殺蟲功效。臨床用于治療細(xì)菌性痢疾、阿米巴痢疾、陰道滴蟲等疾病[1-3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，白頭翁屬植物還有抗微生物、抗蔗糖酶、抗腫瘤等活性。該屬其他幾個種（朝鮮白頭翁、興安白頭翁等）也可作為白頭翁入藥[4]。

目前對白頭翁研究主要集中在藥理、化學(xué)成分分析等方面[5-10]。母錫金等僅對白頭翁[Pulsatilla chinensis（Bunge）Regel]絨氈層的發(fā)育進(jìn)行組織化學(xué)研究[11]；王金平對白頭翁（P.chinensis）花部的形狀及花粉萌發(fā)特性進(jìn)行研究[12]；全雪麗等對朝鮮白頭翁[Pulsatilla cernua（Thunb.）Berchtold Presl]小孢子發(fā)育時期與花器形態(tài)的相關(guān)性進(jìn)行研究[13]。但關(guān)于興安白頭翁整個小孢子發(fā)生與雄配子體發(fā)生問題未見報(bào)道。文章探討興安白頭翁小孢子發(fā)生過程及其與花蕾各部位形態(tài)特征相關(guān)性，旨在為興安白頭翁的栽培、育種以及生殖生物學(xué)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料于2012年5月8～12日取自延吉市周邊地區(qū)自然生長的興安白頭翁不同生長時期的花蕾。

1.2 方法

對采集的一部分新鮮材料進(jìn)行調(diào)查（包括花蕾長度、花絲長度、花藥顏色、花萼內(nèi)外側(cè)顏色變化等）；另一半材料用FAA固定液立即固定并保存帶回實(shí)驗(yàn)室。采用常規(guī)石蠟切片法對不同大小花蕾進(jìn)行切片，切片厚度10～12 μm，番紅-固綠雙重染色法染色，中性樹膠封片，用OLYIMPUS顯微鏡觀察，找出各發(fā)育時期，并進(jìn)行顯微照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 興安白頭翁小孢子各發(fā)育階段細(xì)胞學(xué)特征

興安白頭翁每朵花內(nèi)有數(shù)枚雄蕊（見圖版Ⅰ-1），每個花藥具4個花粉囊（見圖版Ⅰ-2）。隨著花藥的發(fā)育，4個孢原細(xì)胞通過平周分裂形成初生造孢細(xì)胞（內(nèi)層）和初生周緣源細(xì)胞（外層），初生造孢細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂形成數(shù)個小孢子母細(xì)胞。小孢子母細(xì)胞大、排列緊密、核大（見圖版Ⅰ-3～4）。小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂第一次分裂后沒有發(fā)現(xiàn)形成細(xì)胞壁，無二分體時期（見圖版Ⅰ-5～6）。之后進(jìn)入減數(shù)分裂的第二次分裂，形成四面體型四分體（見圖版Ⅰ-7），未觀察到其他類型的四面體。減數(shù)分裂的胞質(zhì)分裂屬同時型。新形成的小孢子四分體被胼胝質(zhì)壁所包圍，隨著胼胝質(zhì)壁的消失，4個小孢子分散開（見圖版Ⅰ-8）。

2.2 花藥壁的發(fā)育

初生周緣細(xì)胞進(jìn)行分裂、分化成花藥壁?；ㄋ幈谠诎l(fā)育初期各層之間無太大區(qū)別（見圖版Ⅰ-3）。隨著花粉母細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂期，花粉囊壁的分化也慢慢形成，從外至內(nèi)的細(xì)胞層依次為：表皮（1層）、藥室內(nèi)壁（1層）、中層（1～2層）、絨氈層（1層）（見圖版Ⅰ-7）。在不同花藥中，不同部位中層細(xì)胞層數(shù)不同，有的1層，有的2層。

表皮細(xì)胞是扁平狀，細(xì)胞核大。為了適應(yīng)花藥的長大和伸長，表皮在發(fā)育過程中進(jìn)行垂周分裂。花藥成熟時表皮細(xì)胞仍然存在于最外層，但形態(tài)變得不規(guī)則（見圖版Ⅰ-11～13）。

藥室內(nèi)壁在于表皮內(nèi)側(cè)，細(xì)胞核大。藥室內(nèi)壁細(xì)胞于四分體時期開始徑向延長，體積逐漸變大，隨后在2-細(xì)胞時期（見圖版Ⅰ-11）出現(xiàn)纖維加厚，此加厚帶為纖維素性質(zhì)，因此這時的藥室內(nèi)壁亦稱為纖維層。

中層位于藥室內(nèi)壁的內(nèi)側(cè)，由1層或2層細(xì)胞組成。中層細(xì)胞一直處于扁平狀，花藥成熟后藥室內(nèi)中層完全解體。

初期的絨氈層細(xì)胞和外側(cè)的藥壁細(xì)胞（表皮、藥室內(nèi)壁、中層）區(qū)別不大，細(xì)胞是單核的。隨著花藥的發(fā)育，絨氈層細(xì)胞體積逐漸變大，細(xì)胞質(zhì)濃。從小孢子母細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂開始一直到四分體時期，絨氈層發(fā)育達(dá)到最大值，出現(xiàn)2核至多核（見圖版Ⅰ-3～7）。四分體時期后絨氈層細(xì)胞逐漸解體，當(dāng)花粉成熟后，絨氈層細(xì)胞完全自溶（見圖版Ⅰ-11～13）。絨氈層在整個發(fā)育過程中都處于原來的位置，屬腺質(zhì)絨氈層（或分泌型）。

最終成熟的花藥壁只剩下表皮細(xì)胞和藥室內(nèi)壁兩層。

2.3 興安白頭翁雄配子體發(fā)育

四分體時期的小孢子在胼胝質(zhì)酶的作用下彼此分離，分離的小孢子游離在花粉囊中，這時細(xì)胞小，但細(xì)胞核很明顯，位于細(xì)胞中央，這時處于單核中央期，形態(tài)上也不規(guī)則（見圖版Ⅰ-8）；小孢子進(jìn)一步發(fā)育后體積逐漸增大，形態(tài)上逐漸呈長橢圓形，且在后期花粉囊壁上出現(xiàn)三條萌發(fā)溝（見圖版Ⅰ-9～10）；小孢子核移到花粉壁一側(cè)成為單核靠邊期花粉（見圖版Ⅰ-9～10），隨后小孢子核靠近花粉壁的位置進(jìn)行有絲分裂，結(jié)果形成兩個核，一個是體積較大的營養(yǎng)核，另一個是體積較小的生殖核（見圖版Ⅰ-11），成熟時的二胞花粉，體積較小的生殖細(xì)胞變成彎月形（見圖版Ⅰ-12）。在極個別的花粉囊中發(fā)現(xiàn)發(fā)育畸形的小孢子四分體，表現(xiàn)為四分體小孢子收縮、變形，無法辨別出細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)（見圖版Ⅰ-14），與正常發(fā)育的四分體（見圖版Ⅰ-7）有明顯區(qū)別。

圖版I 興安白頭翁小孢子發(fā)生及雄配子體的形成Plate I Microsporogenesis and male gametophyte formationin of P.dahurica(Fisch.)Spreng

2.4 興安白頭翁花器形態(tài)與小孢子發(fā)育相關(guān)關(guān)系

興安白頭翁花屬于單生，生于花葶頂端，屬兩性花（見圖版Ⅰ-1）?；ㄝ?枚，花瓣?duì)睿研位颡M卵形，紫色或粉色（隨著花瓣的長大顏色逐漸變淡），外被長毛，內(nèi)側(cè)無毛；雄蕊多數(shù)（見圖版Ⅰ-15～16）?；ㄆ餍螒B(tài)調(diào)查如表1所示，興安白頭翁的花藥由初期的淡綠色變?yōu)楹笃诘狞S色，花萼內(nèi)側(cè)顏色由初期的深紫色變?yōu)楹笃诘姆凵?，花萼外?cè)顏色由初期的深紫色變?yōu)楹笃诘姆凵；ɡ匍L度大于2.0 cm時花瓣開放。

興安白頭翁小孢子發(fā)育與花器形態(tài)的相關(guān)性如表2所示。

表1 興安白頭翁花器形態(tài)調(diào)查Table 1 Investigation of flower organ morphology for P.dahurica(Fisch.)Spreng

表2 興安白頭翁小孢子發(fā)育與花器形態(tài)相關(guān)性Table 2 Correlation of microspore development and flower organ morphology for P.dahurica(Fisch.)Spreng

從表2中可知，在某一個花蕾長度梯度內(nèi)出現(xiàn)幾個不同時期小孢子，這是由于興安白頭翁一朵花內(nèi)數(shù)枚雄蕊發(fā)育時期不一致導(dǎo)致（外側(cè)雄蕊先熟，內(nèi)側(cè)雄蕊后熟）。

3 討論與結(jié)論

興安白頭翁一朵花內(nèi)包含很多雄蕊和雌蕊，每個雄蕊花藥具有4個花粉囊，這與大多植物花藥具備花粉囊數(shù)一致。

興安白頭翁胚胎學(xué)特征表現(xiàn)為：小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂的胞質(zhì)分裂屬同時型，小孢子四分體屬四面體型，絨氈層發(fā)育屬分泌型，成熟花粉粒屬2-細(xì)胞花粉粒，花粉粒有3條萌發(fā)溝。興安白頭翁花藥壁由4層細(xì)胞組成，表皮（1層）、藥室內(nèi)壁（1層）、中層（1～2層）和絨氈層（1層）。藥室內(nèi)壁在后期有纖維加厚現(xiàn)象。興安白頭翁與同屬植物朝鮮白頭翁[13]花粉發(fā)育特征基本一致。

研究表明，植物單倍體植株誘導(dǎo)率與所取材料花粉的發(fā)育時期有密切相關(guān)性，處于單核靠邊期的花粉小孢子細(xì)胞易于誘導(dǎo)胚狀體發(fā)生[14-15]。本試驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，興安白頭翁小孢子各發(fā)育時期與花蕾長度具有相關(guān)性，但由于一朵花蕾內(nèi)部多數(shù)雄蕊發(fā)育時期不同步，很難測量小孢子某一個時期花蕾長度。只能大概估測在花蕾長度0.6～0.7 cm時處于單核期花藥較多，該階段花藥較易誘導(dǎo)胚狀體。

植物有性生殖對于其生命延續(xù)和種群擴(kuò)展起決定作用，該過程任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)障礙，都會造成生殖失敗。本研究對興安白頭翁減數(shù)分裂染色體行為進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其染色體行為無異?，F(xiàn)象，且就其小孢子發(fā)育形態(tài)來看，不育可能性很小。

本研究發(fā)現(xiàn)，興安白頭翁極個別花粉囊中發(fā)現(xiàn)發(fā)育畸形的小孢子四分體，但后期很少發(fā)現(xiàn)發(fā)育畸形花粉粒，具體原因有待于進(jìn)一步研究。興安白頭翁一朵花蕾內(nèi)部數(shù)枚雄蕊之間，同一花藥不同花粉囊之間出現(xiàn)小孢子發(fā)育不同步現(xiàn)象。趙樺等認(rèn)為這是植物對延長傳粉期的適應(yīng)性表現(xiàn)[16]。

[1]鄭光浩,裴曉玲,金研,等.興安白頭翁常春藤皂苷元的含量測定[J].延大醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào),2012,35(1):30-32.

[2]孫輝,李茜,葉文才,等.興安白頭翁根莖的化學(xué)成分研究[J].中草藥,2008,39(6):819-822.

[3]馮永剛,張國秀,田慶雙.興安白頭翁花皂甙含量的測定[J].中國林副特產(chǎn),2005(2):25-26.

[4]李海燕,李宏博,郝寧,等.白頭翁屬藥用植物的HPLC指紋特征與化學(xué)分類研究[J].中國中藥雜志,2011,36(11):1478-1482.

[5]張慶文,葉文才,趙守麗,等.朝鮮白頭翁的三萜皂苷成分研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2000,35(10):756-759.

[6]Bang S C,Kim Y,Lee J H,et al.Triterpenoid saponins from the roots of Pulsatiooa koreana[J].J Nat Prod,2005,68(2):268-272.

[7]俞浩.白頭翁藥理作用研究進(jìn)展[J].中國獸藥雜志,2006,40(7): 51-54.

[8]付云明,陳虹,劉岱琳,等.朝鮮白頭翁化學(xué)成分的研究[J].中草藥,2008,39(1):26-29.

[9]劉顯軍,陳靜,尚麗娟.白頭翁皂苷的提取及抑菌活性試驗(yàn)[J].中國獸醫(yī)雜志,2012,48(1):69-70.

[10]李文超,時維靜,顧有方,等.白頭翁不同提取物抑菌作用研究[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志,2011,13(2):38-40.

[11]母錫金,王伏雄,王文玲.白頭翁絨氈層和周絨氈層膜的發(fā)育和組織化學(xué)研究[J].植物學(xué)報(bào),1988,30(1):6-13.

[12]王金平.白頭翁花部形狀及花粉萌發(fā)特性研究[J].河南師范大學(xué)學(xué)報(bào),2009,37(3):112-115.

[13]全雪麗,裴曉玲,呂惠子,等.朝鮮白頭翁小孢子發(fā)育時期與花器形態(tài)的相關(guān)性研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2013,29(1):145-149.

[14]Kott L S,Plosoni L,Beversdorf W D.Cytological aspects of isolated microspore culture of Brassica napus L.[J].Call J Bot,1988, 66:1658-1664.

[15]鄒金美,張國光,潘一山.羽衣甘藍(lán)花藥培養(yǎng)技術(shù)體系的研究[J].漳州師范學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2005,18(2):94-97.

[16]趙樺,孟華菊,徐娟.七葉樹小孢子發(fā)生及雄配子體發(fā)育研究[J].西北植物學(xué)報(bào),2011,31(2):217-222.

Study on microspore development and male gametophytes formation ofPulsatilla dahurica(Fisch.)Spreng

QUAN Xueli1,JIN Yinghua1,WU Songquan1, XIE Mingxing1,LV Huizi2(1.School of Agricultural,Yanbian University,Yanji Jilin 133000,China; 2.School of Pharmacy,Yanbian University,Yanji Jilin 133000,China)

The paper studied cytological characteristics of microspores during different developments and correlations with bud size forPulsatilla dahurica(Fisch.)Spreng by the methods of paraffin section.The results showed that each flower had several stamens,each anther had four pollen sacs, the microspore mother cells belonged to the simultaneous type of meiosis,and microspore tetrads were tetrahedral.The mature pollens belonged to the two-cell type with three germination aperture;the pollen sac wall was composed of four layers,epidermis,endothelium,middle layer,and tapetum;and the tapetum belonged to glanduar tapetum type(or secretory type)with multinucleate phenomenon.There was asynchronous for microspore development of the same buds in different anthers and the same anthers in different pollen sacs.

Pulsatilla dahurica(Fisch.)Spreng;microspore;male gametophyte;development

Q944.57

A

1005-9369（2014）05-0059-05

2013-12-03

吉林省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科技項(xiàng)目（08sys-101）

全雪麗（1973-），女，副教授，博士，研究方向?yàn)橹参飳W(xué)解剖與分類。E-mail:qxl2000@aliyun.com

時間2014-5-12 9:01:17[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140512.0901.016.html

全雪麗,金英花,吳松權(quán),等.興安白頭翁小孢子發(fā)育與雄配子體形成的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(5):59-63.

Quan Xueli,Jin Yinghua,Wu Songquan,et al.Study on microspore development and male gametophytes formation ofPulsatilla dahurica(Fisch.)Spreng[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(5):59-63.(in Chinese with English abstract)