瘤果黑種草子提取物對慢性阻塞性肺病大鼠模型肺部炎癥的影響

耿東升， 李學(xué)強(qiáng)， 陳雪蓮， 陳 明

(新疆軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗所，新疆 烏魯木齊830063)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是以氣流受限為主要特征，與肺部的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)［1］。目前認(rèn)為氣道慢性炎癥反應(yīng)是造成慢性阻塞性肺病的主要原因，炎癥細(xì)胞的趨化、激活及炎癥因子的釋放是慢性阻塞性肺病氣道慢性炎癥的中心環(huán)節(jié)［2］。本實驗將采用脂多糖加霧化吸入木瓜蛋白酶建立慢性阻塞性肺病大鼠模型探討瘤果黑種草子提取物(油脂、非油脂)對該疾病肺部炎癥的影響，并初步研究其抗炎作用機(jī)制。

1 材料

1.1 藥物與試劑 瘤果黑種草子購自新疆和田墨玉縣，經(jīng)新疆中藥民族藥研究所研究員李曉瑾鑒定為Nigella Glandulifera Freyn 的種子，批號2011308;稱取干燥已粉碎黑種草子置于超臨界CO2萃取釜中，經(jīng)預(yù)實驗確定萃取條件(萃取溫度40 ℃，萃取壓力29 MPa，解析壓力I 12 MPa，溫度56 ℃，解析壓力II 6 MPa，溫度50 ℃，萃取時間2 h，)至萃取物不再增加為止，收集超臨界萃取物即為黑種草子中的油脂類，油脂類加入2%吐溫-80，配成相應(yīng)給藥質(zhì)量濃度溶液;萃取釜中的草子即為黑種草子的非油脂類，非油脂類溶于0.5% CMC-Na，配成相應(yīng)給藥質(zhì)量溶液;戊巴比妥鈉(25 g/瓶，中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司，批號F20030816);脂 多 糖 (lipopolysaccharides，LPS)(10 mg/支，美國Sigma 公司，批號L2880);木瓜蛋白酶(5 g/瓶，美國Sigma 公司，批號20120630);氨茶堿(0.1 g/片，四川錫成藥業(yè)有限公司，批號11070203);大鼠TNFα、IL-8、NF-κB 酶聯(lián)免疫分析試劑盒，購于上海依科賽生物科技有限公司。

1.2 動物 SD 大鼠，雄性，清潔級，體質(zhì)量180 ～220 g，購自于新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號為SCXK (新)2011-0004。

1.3 儀器 AB104-N 型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);3K30 型低溫超速離心機(jī)(美國Sigma 公司);HV-20 型無油空壓機(jī) (濟(jì)南浩偉實驗儀器有限公司);xMark 酶標(biāo)分析儀(美國BIO-RAD 公司);CX31 光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS 公司)。

2 方法

2.1 慢性阻塞性肺病大鼠模型的建立［3-6］造模組于實驗第l、15 日，采用0.3%戊巴比妥鈉溶液0.01 mL/g 腹腔注射麻醉大鼠后仰臥位固定于操作臺，在無菌條件下切開頸部正中皮膚，鈍性分離各層組織后暴露氣管，1 mL 注射器針頭刺入大鼠氣管軟骨環(huán)間隙，緩慢注入1 mg/mL LPS 200 μL于氣管內(nèi)，正常對照組在相同條件下注入等體積生理鹽水，后即刻縫合切口并做消毒處理，注藥后將大鼠直立，左右旋轉(zhuǎn)3 min，使藥液在肺部分布均勻，清醒后常規(guī)飼養(yǎng)3 d 后各組大鼠霧化吸入木瓜蛋白酶5 g/L，每5 只大鼠2 mL，每次10 min，隔日重復(fù)5 次，造模期28 d。

2.2 分組與給藥 將56 只大鼠隨機(jī)分成7 組(每組8只)，分別為正常對照組、模型組、氨茶堿陽性對照組、油脂低、高劑量組，非油脂低、高劑量組，造模結(jié)束后各組分別灌胃給藥1 次/d，連續(xù)20 d。正常對照組和模型組灌胃等體積的生理鹽水。

2.3 一般狀況觀察 觀察各組大鼠在給藥20d 期間體質(zhì)量、毛色、活動量、對外界的靈敏度、飲食、飲水、呼吸狀態(tài)等狀況。

2.4 標(biāo)本采集與處理［7-11］采用0.3%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉后，股動脈放血處死動物。沿氣管打開胸腔分離出肺組織，結(jié)扎左側(cè)支氣管，將3 mL 生理鹽水由支氣管注入右肺，用手輕揉捏肺臟約30 s，隨后抽取灌洗液，重復(fù)2 次，回收約4 mL。取左肺10%中性甲醛固定后送病理。將灌洗液4 ℃下以1 500 r/min 低溫離心15 min，留取上清液-70 ℃冰凍，備檢，余液取細(xì)胞沉渣進(jìn)行炎性細(xì)胞分類。

2.5 各組大鼠肺泡灌洗液中相關(guān)指標(biāo)檢測［10］各組大鼠肺泡灌洗液離心后取細(xì)胞沉渣進(jìn)行瑞士-吉姆薩染色涂片，在光學(xué)顯微鏡下觀察100 ～200 個細(xì)胞，然后對炎性細(xì)胞進(jìn)行分類;采用ELISA 法檢測各組大鼠肺泡灌洗液上清液中TNF-α、IL-8 和NF-κB 的水平，各指標(biāo)均嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作測定。

2.6 肺組織病理學(xué)觀察［12］取左肺下葉用10%中性甲醛固定，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，4 μm 厚度連續(xù)切片2張，進(jìn)行HE 染色，作病理切片檢查。光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)改變并作比較。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般狀況觀察 正常對照組大鼠活潑好動，毛發(fā)光澤，進(jìn)食、進(jìn)水正常，呼吸平穩(wěn)，實驗期間體質(zhì)量穩(wěn)定增加;模型組大鼠拱背豎毛疲軟，被毛萎黃有脫落，進(jìn)食進(jìn)水量減少，活動性較差，精神萎靡，經(jīng)常伴有咳嗽及噴嚏，呼吸急促，體質(zhì)量增長緩慢。油脂、非油脂各給藥組和氨茶堿組大鼠的生存狀況明顯好于模型組。

3.2 對慢性阻塞性肺病大鼠肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞的影響模型組大鼠肺泡灌洗液中巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞所占比例顯著升高，淋巴細(xì)胞比例顯著降低，與正常組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01);氨茶堿組、油脂和非油脂低、高劑量組均可使巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞所占比例明顯降低，淋巴細(xì)胞比例明顯升高，與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01，P ＜0.05)，結(jié)果見表1。

3.3 對慢性阻塞性肺病大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子水平的影響 模型組大鼠肺泡灌洗液上清液中TNF-α、IL-8 和NFκB 的水平顯著升高，與正常組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01);氨茶堿組、油脂和非油脂低、高劑量組均可不同程度使慢性阻塞性肺病模型大鼠的TNF-α、IL-8 及NF-κB 的水平降低，與模型組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01，P ＜0.05)，結(jié)果見表2。

表1 對慢性阻塞性肺病大鼠肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞的影響(±s，n=8)

表1 對慢性阻塞性肺病大鼠肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞的影響(±s，n=8)

注:與正常對照組比較，▲▲P ＜0.01，▲P ＜0.05;與模型組比較，＊＊P ＜0.01，*P ＜0.05

組別 劑量/(mg·kg -1)炎性細(xì)胞分類巨噬細(xì)胞 中性粒細(xì)胞 淋巴細(xì)胞正常- 0.18±0.03 0.11±0.01 0.71±0.03模型 - 0.34±0.02▲▲ 0.20±0.02▲▲ 0.45±0.03▲▲氨茶堿 71.5 0.22±0.02＊＊ 0.15±0.02＊＊ 0.63±0.02＊＊油脂 193 0.29±0.04* 0.19±0.02 0.52±0.05*772 0.25±0.02＊＊ 0.15±0.03＊＊ 0.60±0.02＊＊非油脂 450 0.24±0.03＊＊ 0.16±0.03＊＊ 0.60±0.04＊＊1 800 0.29±0.03* 0.17±0.02* 0.54±0.03*

3.4 對慢性阻塞性肺病大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)的影響 大體標(biāo)本肉眼所見:正常對照組大鼠兩肺外表光滑柔軟，呈淡粉肉色，肺部體積大小適中，抽吸灌洗液時彈性較好;模型組大鼠兩肺外表粗糙略硬，呈暗紅偏紫并有凹凸不平蒼白灶，肺部體積明顯增大，彈性較差。給藥20 d 后，油脂和非油脂各治療組大鼠雙肺外表較光滑、彈性較好、體積無明顯改變，與模型組比較總體改善較明顯，但比氨茶堿組效果差。光鏡HE 染色所見:正常對照組支氣管黏膜上皮細(xì)胞排列整齊，支氣管黏膜下未見明顯炎細(xì)胞浸潤，

表2 對慢性阻塞性肺病大鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-8及NF-κB 水平的影響(±s，n=8)

表2 對慢性阻塞性肺病大鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-8及NF-κB 水平的影響(±s，n=8)

組別劑量/(mg·kg -1)TNF-α/(ng·mL -1)IL-8/(ng·mL -1)NF-κB/(ng·mL -1)- 0.23±0.02 0.49±0.07 0.40±0.03模型 - 0.37±0.05▲▲ 0.98±0.05▲▲ 0.86±0.24▲▲氨茶堿 71.5 0.27±0.03＊＊ 0.59±0.06＊＊ 0.52±0.13＊＊油脂 193 0.31±0.02 0.84±0.15 0.63±0.22 772 0.30±0.05* 0.81±0.14* 0.58±0.11*非油脂 450 0.30±0.04＊＊ 0.68±0.06＊＊ 0.56±0.17＊＊1 800 0.31±0.05* 0.80±0.15* 0.62±0.16對照*

注:與正常對照組比較，▲▲P ＜0.01，▲P ＜0.05;與模型組比較，＊＊P ＜0.01，*P ＜0.05肺泡壁完整，氣管纖毛無損傷脫落，肺泡結(jié)構(gòu)連續(xù)，肺泡腔無擴(kuò)大。慢性阻塞性肺病模型組支氣管黏膜上皮變性壞死脫落，杯狀細(xì)胞增生，局部有鱗狀上皮化生，炎細(xì)胞浸潤(淋巴細(xì)胞為主)，管壁肌層斷裂，肺泡腔、支氣管腔有滲出物，肺泡壁肌層斷裂、擴(kuò)張融合，肺組織結(jié)構(gòu)破壞明顯。給藥20 d 后，油脂、非油脂各治療組大鼠炎性細(xì)胞浸潤較少，有部分肺泡擴(kuò)張融合，有些肺泡腔有部分?jǐn)U大，氣管內(nèi)黏膜纖毛細(xì)胞數(shù)量較多，排列較整齊，肺組織結(jié)構(gòu)破壞有不同程度的緩解，但比氨茶堿改善效果差，見圖1。

圖1 光鏡下肺組織病理學(xué)改變(HE×100)

4 討論

目前，國內(nèi)外對果黑種草、黑種草的研究已較多，但對于瘤果黑種草僅限于部分化學(xué)及醇提物的體外抗氧化、黑種草子油抗血栓作用的研究，而該藥關(guān)于慢性阻塞性肺病藥理作用有效部位的研究，并未見報道。本實驗首次對瘤果黑種草子提取物進(jìn)行了慢性阻塞性肺病相關(guān)作用機(jī)制的研究。

本實驗在借鑒國內(nèi)外建立慢性阻塞性肺病動物模型方法的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，采用氣管內(nèi)注入LPS 和霧化吸入木瓜蛋白酶聯(lián)合復(fù)制慢性阻塞性肺病模型［13-15］，病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)模型大鼠出現(xiàn)慢性支氣管炎及肺氣腫的特征性改變:支氣管管壁結(jié)締組織增生，平滑肌增厚，支氣管纖毛上皮呈鋸齒樣增生增厚并有脫落，可見巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡間隔破裂，肺泡腔不規(guī)則擴(kuò)大，部分相互融合成肺大泡等，證實慢性阻塞性肺病大鼠模型建立成功。經(jīng)過瘤果黑種草子油脂、非油脂治療后，模型大鼠肺組織病理改變程度明顯減輕，肺泡巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞所占炎性細(xì)胞比例與模型組相比明顯降低，同時該藥物也降低了大鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-8 與NF-κB的水平，實驗結(jié)果說明瘤果黑種草子油脂、非油脂有減輕慢性阻塞性肺病大鼠模型肺部炎癥的作用，其抗炎機(jī)制可能與減弱了肺組織內(nèi)的巨噬細(xì)胞對LPS 的反應(yīng)，減少炎癥因子的合成和釋放有關(guān)。我們將進(jìn)一步研究和確定瘤果黑種草子油脂、非油脂發(fā)揮炎癥作用的具體有效部位。

［1］ 中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會慢性阻塞性肺疾病學(xué)組. 慢性阻塞性肺疾病診治指南(2007 年修訂版)［J］. 中華結(jié)核和呼吸雜志，2007，30(1):435-460.

［2］ 劉清敏，劉景艷. 炎癥細(xì)胞與COPD 發(fā)病機(jī)制的關(guān)系［J］.中原醫(yī)刊，2004，31(19):39-41.

［3］ 蔡 健，顧振綸，蔣小崗，等. 黃芩總黃酮對博萊霉素致大鼠肺纖維化的干預(yù)作用及其機(jī)制研究［J］. 中草藥，2012，43(1):119-124.

［4］ 馬 楠，崔德健，梁延杰. 氣管內(nèi)注入脂多糖法建立大鼠慢性支氣管炎模型［J］. 中華結(jié)核和呼吸雜志，1999，22(6):371-373.

［5］ Pfitser G P，Tolker M，Babyak M，et al. Exprimental emphysema:its production with papain in normal and silicotic rats［J］.Arch Environ Health，1965，11(1):50-58.

［6］ 許惠娟，李時悅，林云恩，等. 人工冬蟲夏草聯(lián)合糖皮質(zhì)激素對大鼠肺纖維化的干預(yù)作用［J］. 中國中藥雜志，2011，36(16):2265-2266.

［7］ 管 燕，謝強(qiáng)敏. 甘草黃酮對肺部炎癥小鼠細(xì)胞因子表達(dá)和氧化反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用［J］. 中草藥，2012，43(1):119-124.

［8］ 趙春貞，王 硯，唐法娣，等. 留蘭香油對大鼠慢性阻塞性肺疾病模型肺組織炎癥氧化改變和Nrf2 蛋白表達(dá)的影響［J］. 浙江大學(xué)學(xué)報，2008，37(4):357-363.

［9］ 曾華東，徐 虹，李 理，等. 慢性阻塞性肺疾病大鼠模型肺泡巨噬細(xì)胞炎癥及調(diào)控機(jī)制探討［J］. 中國呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志，2012，11(2):133-137.

［10］ Charokopos N，Apostolopoulos N，Kalapodi M，et al. Bronchial asthma，chronic obstructive pulmonary disease and NF-κB［J］.Curr Medi Chem，2009，16(7):867-883.

［11］ 中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會. 支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞學(xué)檢測技術(shù)規(guī)范 (草案)［J］. 現(xiàn)代實用醫(yī)學(xué)，2003，15(4):256-257.

［12］ 龔志錦，詹容洲. 病理組織制片和染色技術(shù)［M］. 上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1994:156-157.

［13］ 許 滸，熊 密，黃慶華，等. 細(xì)菌感染導(dǎo)致慢性阻塞性肺疾?。跩］. 中華結(jié)核和呼吸雜志，1999，22(12):739-742.

［14］ Blyth D I，Pedrick M S，Savage T J. Lung inflammation an depithelial changes in a murine model of atopic asthma［J］. Am J Respir Cell Mol Biol，1996，14(5):425-438.

［15］ 李紅梅，崔德健，佟 欣. 熏香煙加氣管注內(nèi)毒素和單純熏香煙法建大鼠COPD 模型［J］. 中國病理生理雜志，2002，18(7):808-812.