硫磺熏蒸對天麻有效成分的影響

靳燦燦， 李會軍

(中國藥科大學(xué) 天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室，江蘇 南京210009)

天麻為蘭科植物天麻Gastrodia elata Bl. 的干燥塊莖，具有息風(fēng)止痙、平抑肝陽、祛風(fēng)通絡(luò)之功效，用于小兒驚風(fēng)，癲癇抽搐，破傷風(fēng)，頭痛眩暈，手足不遂，肢體麻木，風(fēng)濕痹痛［1］，為我國傳統(tǒng)名貴中藥。天麻中含有大量水分和多糖，不易干燥與儲存，因而在天麻的產(chǎn)地加工過程中，常用硫磺熏蒸藥材以達(dá)到干燥、漂白、殺菌防腐、改善外觀、易于儲存的目的［2］。雖然硫磺熏蒸對中藥材的加工儲藏起到了一定的積極作用，但現(xiàn)代研究表明硫熏中藥材會導(dǎo)致藥材性狀、化學(xué)成分、藥理作用等的改變［3-6］，以及二氧化硫及砷、汞等重金屬的殘留［7-8］，從而影響中藥的療效及安全性。已有文獻(xiàn)報道硫磺熏蒸會降低天麻中有效成分天麻素的量，導(dǎo)致SO2超標(biāo)［9］，影響飲片湯劑的氣味、色澤、pH 等［10］，但目前硫熏對天麻中除天麻素外其他有效成分影響的報道較少。

本實驗以天麻中的主要活性成分天麻素、對羥基苯甲醇及4 個特征性成分巴利森苷、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E (結(jié)構(gòu)見圖1)為指標(biāo)，建立了HPLC 法同時測定天麻中多個成分的定量分析方法。初步探討了硫熏加工對天麻中6 個主要酚類成分含有量變化的影響，為天麻產(chǎn)地加工提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

圖1 天麻中主要酚類成分的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of the main phenolic compounds in Gastrodiae Rhizoma

1.1 儀器 Agilent 1260 Series 高效液相色譜儀(美國Agilent 公司，包括G1311B 四元泵、G1329B自動進(jìn)樣器、G4212B 二極管陣列檢測器、G1316A柱溫箱、Chemstation B 色譜工作站);HS3120 型超聲波提取器(500 W，100 kHz，昆山禾創(chuàng)超聲儀有限公司);Sartorius BT125D 電子天平(十萬分之一，德國Sartorius 公司);Sartorius BSA124S 電子天平(萬分之一，德國Sartorius 公司);MUL-9000 Series 超純水系統(tǒng)(美國Millipore 公司);數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱GZX-9070 MBE (上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

1.2 材料 乙腈(美國Tedia 公司)、甲醇(江蘇漢邦科技有限公司)為色譜純，水為去離子水，其余試劑均為分析純。

對照品天麻素(成都曼斯特生物科技有限公司，批號11122815)、對羥基苯甲醇(上海阿拉丁試劑公司，批號E1202004)、巴利森苷(上海純優(yōu)生物科技有限公司，批號131012)、巴利森苷B(批號13122013)、巴利森苷C (批號13122301)及巴利森苷E (批號14011606)購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，以上對照品純度均大于98%。

10 批天麻藥材(S1 ～S10)采自云南昭通小草壩、湖北宜昌等種植地，經(jīng)中國藥科大學(xué)李會軍教授鑒定為蘭科植物天麻Gastrodia elata Bl. 的干燥塊莖，憑證標(biāo)本保存于中國藥科大學(xué)天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室。其中，S1、S3、S5、S7、S9 為烘干或曬干的未硫熏樣品，S2、S4、S6、S8、S10 為對應(yīng)的硫熏加工的樣品。S1 ～S6 為產(chǎn)地農(nóng)戶加工，S7 ～S10 為實驗室模擬產(chǎn)地加工。加工方法為:鮮天麻蒸或煮透(約10 ～20 min)后低溫烘干或曬干;或蒸、煮透，燃燒硫磺熏蒸數(shù)小時后曬干或烘干。樣品具體來源及加工方法見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性 采用Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm × 50 mm，1.8 μm);以乙腈(A)-0.02% 磷酸 (B)為流動相，梯度洗脫(0 ～4 min，3% ～10% A;5 ～7 min，10% ～12%A;7 ～12 min，18% A;12 ～15 min，18% ～50%A);檢測波長220 nm;體積流量0.6 mL/min;柱溫30 ℃;進(jìn)樣體積3 μL;理論塔板數(shù)以天麻素計算不低于3 000。色譜圖見圖2。

表1 樣品來源及加工方法Tab.1 Sources and processing method of samples

圖2 天麻HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of Gastrodiae Rhizoma

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷，巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E 對照品適量，置5 mL 量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為0.316 5、0.099 5、0.648、0.261 8、0.110 2、0.407 0 mg/mL 的混合對照品溶液，存放于4 ℃冰箱中備用。

2.3 供試品溶液的制備 取未硫熏和硫熏天麻藥材粉末(過三號篩)各0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加50%甲醇25 mL，稱重，超聲提取30 min，放冷，用50%甲醇補足減失質(zhì)量，搖勻，過0.22 μm 的微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密量取“2.2”項下的混合對照品貯備液0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.5 mL 置6 個5 mL 量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成一系列不同質(zhì)量濃度的對照品溶液。以對照品貯備液作為標(biāo)準(zhǔn)曲線最大濃度。按“2.1”項下色譜條件，分別吸取以上7 個不同質(zhì)量濃度的對照品溶液3 μL 注入高效液相色譜儀，記錄各化合物色譜峰峰面積。以質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得各化合物回歸方程 (見表2)。

表2 天麻中6 個酚類化合物的回歸方程、線性范圍、定量限及檢測限Tab.2 Calibration curves、linear range、LODs and LOQs of six phenolic components in Gastrodiae Rhizoma

2.4.2 精密度試驗 分別精密吸取上述配制好的 同一對照品溶液3 μL，連續(xù)進(jìn)樣6 次，按上述色譜條件測定天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷、巴利森苷B、巴利森苷C 及巴利森苷E 的峰面積，其RSD 值分別為 0.9%、0.4%、0.4%、0.3%、0.5%、0.4%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗 取同一份樣品(S5)6 份，精密測定，按“2.3”項下方法分別制成供試品溶液，按上述色譜條件測定天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷、巴利森苷B、巴利森苷C 及巴利森苷E 的峰面積，其RSD 值分別為1.5%、1.5%、0.8%、0.6%、2.1%、1.1%，結(jié)果表明本法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取天麻藥材粉末(S5)，按“2.3”項下方法制成供試品溶液，在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h 后進(jìn)樣測定天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷、巴利森苷B、巴利森苷C 及巴利森苷E 的峰面積，計算RSD 值分別為0.3%、0.3%、0.2%、0.2%、0.3%、0.3%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收率試驗 取已知含有量的同一批樣品(S5)9 份，每份0.25 g，精密稱定，置錐形瓶中，按低、中、高水平分別精密加入0.5、1.0、1.5 mL 的混合對照品溶液 (天麻素0.65 mg/mL、對羥基苯甲醇0.20 mg/mL、巴利森苷3.22 mg/mL、巴利森苷B1.36 mg/mL、巴利森苷C 0.35 mg/mL 及巴利森苷E1.43 mg/mL)，每個劑量平行3 份，按“2.3”項方法制備供試品溶液，按上述色譜條件檢測，計算各化合物加樣回收率。結(jié)果顯示各化合物加樣回收率均在95% ～105% 之間，且RSD 值＜ 3%，結(jié)果見表3。

2.5 樣品測定 取10 批天麻藥材，按“2.3”項下方法制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液3 μL，注入色譜儀，記錄色譜峰峰面積，以外標(biāo)法計算各樣品溶液中待測化合物的量，結(jié)果見表4。

3 討論

現(xiàn)代研究表明，天麻的主要活性成分是酚類化合物［11-12］，其中天麻素及其苷元對羥基苯甲醇具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗驚厥及神經(jīng)保護(hù)等作用［13-15］，常作為天麻藥材質(zhì)量控制的指標(biāo)成分。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，除天麻素外，天麻素與檸檬酸縮合而成的酯類成分，如巴利森苷、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E 的含有量亦較高［16-17］，可作為定量指標(biāo)用于天麻質(zhì)量評價。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果(n=9)Tab.3 Results of recovery tests (n=9)

表4 樣品測定結(jié)果(n=3)Tab.4 Determination results of samples (n=3)

天麻為傳統(tǒng)習(xí)用硫磺熏蒸的中藥材之一，2011年國家食品藥品監(jiān)督管理局明確規(guī)定其二氧化硫殘留量不得超過400 mg/kg。本實驗結(jié)果顯示，與未硫熏樣品相比，硫磺熏蒸天麻后6 個酚類成分總量均有不同程度的降低，其中有效成分天麻素的量明顯下降，且S2、S4、S6、S8 硫熏樣品中天麻素量低于《中國藥典》天麻【含量測定】項下天麻素不得低于0.2%的限度規(guī)定。除S8 樣品中對羥基苯甲醇，S4 樣品中巴利森苷C 及S6 樣品中巴利森苷E 的量較其未硫熏樣品有增加外，其他硫熏組各成分的量均呈減少趨勢。推測原因可能是硫磺熏蒸天麻導(dǎo)致天麻素和巴利森苷發(fā)生水解作用，生成天麻苷元、巴利森苷C、巴利森苷E，由于硫磺用量、熏制時間及熏蒸次數(shù)的差異而導(dǎo)致對羥基苯甲醇、巴利森苷C 及E 的量出現(xiàn)不同程度增加。以上實驗表明硫磺熏蒸對天麻有效成分有一定的損失，建議在今后的產(chǎn)地加工過程中應(yīng)嚴(yán)格控制硫熏天麻，避免過度硫熏影響藥效及用藥的安全性。硫磺熏蒸導(dǎo)致天麻化學(xué)成分變化的原因及機(jī)制、新化學(xué)成分的產(chǎn)生及對藥理作用的影響還有待進(jìn)一步深入研究。

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