山楂葉總黃酮對2 型糖尿病大鼠腎臟IGF-1 和IGFBP-3 表達(dá)的影響

趙曉蓮， 齊淑芳* ， 張 波， 楊馨妍， 張丹鳳

(1. 佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯154007;2. 佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯154000)

糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病(Diabetic Mellitus，DM)最常見、最嚴(yán)重的慢性微血管并發(fā)癥之一，其進(jìn)展速度約為其他類型腎病的14 倍，若不給予適當(dāng)治療，常在5 ～10 年內(nèi)發(fā)展至終末期腎功能衰竭而死亡。因此，探討糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制進(jìn)而尋求有效的治療手段一直是糖尿病研究領(lǐng)域的重要課題。山楂葉總黃酮(Hawthorn Leaves Flavonoids)具有廣泛的藥理作用，如強(qiáng)心、降血壓、增加冠脈流量、降糖、調(diào)血脂、抗脂質(zhì)過氧化、抑制或清除自由基、抗腫瘤、抗疲勞等［1］。近年來，山楂葉總黃酮在降血糖、調(diào)血脂、抗腦缺血等研究方面取得了重大進(jìn)展，但有關(guān)其對糖尿病腎病的影響及機(jī)制的研究較少，尤其對糖尿病腎臟IGF-1 及IGFBP-3 影響的研究國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究通過復(fù)制2 型糖尿病腎病大鼠模型，給予山楂葉總黃酮干預(yù)治療后，觀察大鼠腎臟IGF-1、IGFBP-3 的表達(dá)情況，從不同的角度探討山楂葉總黃酮對2 型糖尿病腎病的治療作用及可能機(jī)制，為糖尿病腎病的靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選擇健康Wistar 大鼠46 只，清潔級，3 ～4 月齡，體質(zhì)量(220 ±20)克，雌雄各半，由黑龍江省佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 主要藥物、試劑和儀器 山楂葉總黃酮:臨沂愛康藥業(yè)有限公司(批號423706，純度90% );中效胰島素注射劑(賽諾菲-安萬特公司批號11041410);鏈脲佐菌素(美國Sigma 公司);RT-PCR 試劑盒及相關(guān)輔助試劑(大連寶生物工程有限公司);引物合成(上海生工生物工程有限公司)。PCR 儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、血糖儀。

1.3 模型制備及分組 46 只健康大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為兩組:正常對照組10 只和糖尿病模型組36 只。將36 只2 型糖尿病組大鼠給予高脂高糖飲食喂養(yǎng)4 周后，禁食16 h (自由飲水)，按50 mg/kg 一次性腹腔注射STZ注射劑，繼續(xù)高脂高糖飲食4 周。正常對照組大鼠，給予基礎(chǔ)飼料飲食，4 周后注射等體積的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液。各組大鼠于實(shí)驗(yàn)9 周后尾靜脈采血測空腹血糖(FBG)、留尿測24 h 尿蛋白。2 型糖尿病腎病組以空腹血糖≥16.8 mmol/L 且出現(xiàn)蛋白尿者為2 型糖尿病腎病大鼠造模成功［2］。將篩選后造模成功的30 只2 型糖尿病腎病大鼠隨機(jī)分為3 組:STZ 糖尿病腎病模型對照組、山楂葉總黃酮組、胰島素治療對照組，每組10 只，繼續(xù)給予高脂高糖飼養(yǎng)的同時，山楂葉總黃酮組給予山楂葉總黃酮200 mg/(kg·d)(依據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)定)，灌胃;正常對照組及STZ-糖尿病腎病組給予等量蒸餾水灌胃;胰島素治療對照組每天6 pm 給予中效胰島素1 ～2 U 皮下注射。藥物干預(yù)12 周后，所有大鼠稱定質(zhì)量、測24 h 尿蛋白、內(nèi)眥靜脈取血、取材后處死。

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 全自動生化儀檢測血脂、肌酐 (BCr)、尿素氮(BUN)、尿蛋白(Upr)等生化指標(biāo)。采用血糖儀測定血糖。

1.4.2 腎組織形態(tài)學(xué)觀察 各組大鼠腎組織甲醛固定、脫水、浸蠟、包埋、切片(片厚4 μm)后，HE 染色及PAS染色，光鏡下觀察。對PAS 染色切片進(jìn)行分析。每張切片隨機(jī)取20 個完整的腎小球，計(jì)算腎小球細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的相對面積。

1.4.3 RT-PCR 法檢測腎組織IGF-1、IGFBP-3 mRNA 的表達(dá) 按Trizol 法試劑盒操作提取腎皮質(zhì)總RNA;按RT-PCR試劑盒說明操作合成cDNA;PCR 反應(yīng)擴(kuò)增DNA (各引物序列及擴(kuò)增條件見表1)。用凝膠圖像成像分析系統(tǒng)拍攝并分析結(jié)果，以目的基因與β-actin 吸光度的比值表示其相對含有量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)以±s 表示;組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;指標(biāo)之間的相關(guān)性分析采用t 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 山楂葉總黃酮對血糖、血脂的影響 模型組大鼠血糖明顯升高，血脂代謝紊亂，經(jīng)山楂葉總黃酮治療后血糖下降，血脂代謝紊亂明顯改善，與治療對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表2)。

表1 引物序列及擴(kuò)增條件

表2 山楂葉總黃酮對血糖、血脂的影響(±s，n=8)(mmol/L)

表2 山楂葉總黃酮對血糖、血脂的影響(±s，n=8)(mmol/L)

注:與正常組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，##P ＜0.01

組別 血糖 甘油三酯 總膽固醇 低密度脂蛋白 高密度脂蛋白正常組 9.501 ±2.221 0.689 ±0.101 1.498 ±0.190 0.231 ±0.034 2.578 ±0.251模型組 22.346 ±4.428＊＊ 2.560 ±0.205＊＊ 4.682 ±0.300＊＊ 0.755 ±0.043＊＊ 1.618 ±0.178＊＊陽性組 8.933 ±2.996## 0.785 ±0.126## 1.635 ±0.175## 0.259 ±0.022## 2.448 ±0.192##山楂葉總黃酮組 11.061 ±3.603## 0.876 ±0.133## 1.785 ±0.192## 0.268 ±0.030## 2.263 ±0.205*##

2.2 山楂葉總黃酮對腎功能及腎組織結(jié)構(gòu)的影響 模型組大鼠尿蛋白明顯升高，腎臟功能明顯降低。而山楂葉總黃酮能顯著降低尿蛋白，改善腎功能，其效果與胰島素治療組無明顯差異。

HE 及PAS 染色后，鏡下可見正常組大鼠腎小球、腎小管形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，腎小球毛細(xì)血管基底膜、系膜、基質(zhì)未見明顯異常，腎小管形狀規(guī)則，未見肥大。模型組大鼠腎小球系膜細(xì)胞增生，部分腎小球硬化，腎小管上皮細(xì)胞腫脹、壞死，腎小球系膜區(qū)增寬，系膜基質(zhì)明顯增多，基底膜增厚，正常腎小管減少，擴(kuò)張腎小管增加，病理改變明顯。各治療組較模型組均有不同程度改善，且山楂葉總黃酮組與治療對照組比較腎小球細(xì)胞外基質(zhì)的相對面積無明顯差異(見表3)。

表3 山楂葉總黃酮對腎功能、ECM 的影響(±s，n=8)

表3 山楂葉總黃酮對腎功能、ECM 的影響(±s，n=8)

注:與正常組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，##P ＜0.01

組別 24 h 尿蛋白/(mg·24 h -1) 血肌酐/(μmol·L -1) 尿素氮/(mmol·L -1)ECM正常組 10.953 ±1.421 55.592 ±10.556 10.659 ±1.333 0.038 ±0.011模型組 34.802 ±2.815＊＊ 116.523 ±12.688＊＊ 21.224 ±1.695＊＊ 0.120 ±0.015＊＊陽性組 13.002 ±1.365* ## 62.355 ±7.862## 11.588 ±1.100## 0.062 ±0.006＊＊##山楂葉總黃酮組 14.045 ±1.550* ## 69.348 ±9.900* ## 11.532 ±1.008## 0.056 ±0.007＊＊##

2.3 山楂葉總黃酮對腎組織中IGF-1、IGFBP-3 mRNA 表達(dá)的影響 正常組大鼠腎組織中均可見IGF-1、IGFBP-3 mRNA 的表達(dá)，模型組的表達(dá)明顯增加。經(jīng)山楂葉總黃酮治療后大鼠腎組織IGF-1、IGFBP-3 mRNA 的表達(dá)均明顯減少且兩者成正相關(guān)(P ＜0.01，r =0.994)。山楂葉總黃酮組與治療對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表4 及圖1、2)。

3 討論

GH/IGF-1 軸是由GH、IGF-1、IGF-1R 及IGFBPs 組成的復(fù)雜系統(tǒng)，該軸系統(tǒng)保持動態(tài)平衡對機(jī)體組織的分化、增殖及物質(zhì)代謝具有極其重要的調(diào)節(jié)作用［3］。大量動物、臨床實(shí)驗(yàn)表明［4-5］，糖尿病患者體內(nèi)存在GH/IGF-1 軸系統(tǒng)的紊亂，這種紊亂不僅加劇糖尿病患者的高血糖，而且可促進(jìn)糖尿病慢性并發(fā)癥如糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病、糖尿病神經(jīng)病變的發(fā)生、發(fā)展。近年來的研究證實(shí)，腎臟局部GH/IGF-I 的紊亂參與了糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展。其中，IGF-1 及IGFBP-3 在2 型糖尿病腎病早期發(fā)病中的作用已引起臨床醫(yī)師的重視。

表4 山楂葉總黃酮對腎組織中IGF-1、IGFBP-3 mRNA 表達(dá)的影響(±s，n=8)

表4 山楂葉總黃酮對腎組織中IGF-1、IGFBP-3 mRNA 表達(dá)的影響(±s，n=8)

注:與正常組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，##P ＜0.01

組別 (IGF-1/β-actin) (IGFBP-3/β-actin)0.387 ±0.016 0.296 ±0.020模型組 0.640 ±0.013＊＊ 0.403 ±0.009＊＊陽性組 0.406 ±0.015* ## 0.334 ±0.016＊＊##山楂葉總黃酮組 0.412 ±0.021* ## 0.345 ±0.021＊＊##正常組

圖1 IGF-1 mRNA 的表達(dá)

圖2 IGFBP-3 mRNA 的表達(dá)

IGF-1 普遍存在于哺乳動物的組織中，大部分IGF-1 與IGFBPs 結(jié)合，以非游離狀態(tài)存在，而只有少部分游離的IGF-1 不與任何IGFBP 結(jié)合，可以與其受體IGF-1R 結(jié)合，發(fā)揮其促進(jìn)細(xì)胞生長、抑制細(xì)胞凋亡的生物活性。正常生理?xiàng)l件下，IGF-1 系統(tǒng)不能導(dǎo)致腎組織損害，只有在機(jī)體損傷，如在糖尿病條件下，才會導(dǎo)致細(xì)胞增殖［6］。糖尿病腎病早期出現(xiàn)的腎臟肥大、腎小球高濾過、腎小球系膜細(xì)胞增生及ECM 聚積與IGF-1 密切相關(guān)，其過度表達(dá)對糖尿病腎病的發(fā)生具有始動作用。

糖尿病腎病時腎組織中IGF-1 表達(dá)增高的原因可能為:①高血糖導(dǎo)致缺氧，引起機(jī)體氧化還原系統(tǒng)紊亂，進(jìn)而引發(fā)蛋白激酶C 的失活，最終導(dǎo)致IGF-1 的生成增多［7］;②高糖可使腎小球系膜細(xì)胞IGF-1 表達(dá)增加;③高糖可使腎臟成纖維細(xì)胞IGF-1 表達(dá)上調(diào)［8］;④有學(xué)者［9］報(bào)道，在糖尿病腎病發(fā)病過程中，由于外周循環(huán)血中IGF-1 的增加導(dǎo)致腎臟IGF-1 積聚，但腎臟本身IGF-1 mRNA 的表達(dá)并不增加，其原因可能與IGFBPs 表達(dá)有關(guān);⑤有學(xué)者［10］研究認(rèn)為，糖尿病腎病的腎小球系膜損傷引起腎臟局部IGF-1 的旁分泌合成代償性增多，同時其降解減少，最終導(dǎo)致IGF-1 水平增高;⑥糖尿病腎病時，伴隨腎臟IGF-1 表達(dá)的增加，IGFBP-3 表達(dá)也增加，提示IGFBP-3 可能通過調(diào)節(jié)腎臟局部IGF-1 的自分泌和(或)旁分泌，導(dǎo)致腎臟IGF-1 合成增加。

腎臟IGF-1 的過度表達(dá)導(dǎo)致糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展，其機(jī)制為［11］:①IGF-1 能使系膜細(xì)胞增殖引起腎臟增大;②高糖條件下，IGF-1 可促進(jìn)系膜細(xì)胞分泌大量NO，導(dǎo)致腎小球入球小動脈擴(kuò)張，從而引起GFR 增加;③IGF-1 可引起脂質(zhì)沉積，形成泡沫細(xì)胞，損害系膜細(xì)胞功能;④IGF-1 通過誘導(dǎo)系膜細(xì)胞產(chǎn)生大量的纖維連接蛋白、膠原蛋白Ⅳ和層黏蛋白，促進(jìn)細(xì)胞的進(jìn)一步增生和基質(zhì)的進(jìn)一步增多，從而對系膜細(xì)胞產(chǎn)生持久作用，最終導(dǎo)致腎小球硬化;⑤IGF-1 通過誘導(dǎo)腎臟激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)和腎素釋放增加，從而改變腎小球的血流動力學(xué);⑥IGF-1 可持續(xù)降低金屬蛋白酶2 的活性，從而使系膜膠原蛋白降解減少，ECM 堆積，導(dǎo)致腎小球硬化。

機(jī)體各種組織幾乎均可合成、分泌IGFBPs，這些結(jié)合蛋白質(zhì)作為生物應(yīng)答的緩沖劑，具有重要的生物學(xué)意義。迄今已發(fā)現(xiàn)6 種IGFBPs (IGFBP1-6)，其中IGFBP-3 是人體中數(shù)量最多，作用最強(qiáng)的結(jié)合蛋白，其通過與IGF-1 結(jié)合而阻止IGF-1 降解，延長其半衰期，從而調(diào)節(jié)IGF-1 的生物學(xué)有效性和生物學(xué)活性。

本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR 和免疫組化的方法研究了STZ-糖尿病腎病大鼠腎組織IGF-1 和IGFBP-3 的mRNA 水平的表達(dá)。結(jié)果顯示，模型組大鼠IGF-1 和IGFBP-3 在腎小球、近曲小管、遠(yuǎn)曲小管和集合管中的表達(dá)均較正常組明顯增加。提示糖尿病腎病早期腎臟IGF-1 和IGFBP-3 的異常表達(dá)參與了糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展。結(jié)果也顯示IGF-1、IGFBP-3 呈顯著正相關(guān)，說明IGF-1 水平與IGFBP-3 有關(guān)，提示IGFBP-3 可能調(diào)節(jié)IGF-1 在腎組織中的水平。同時也說明在導(dǎo)致糖尿病腎病的過程中，IGF-1 與IGFBP-3 可能有協(xié)同作用。

山楂葉總黃酮是山楂葉中黃酮類化合物的總稱，也是山楂葉生理活性的主要成分，具有降糖、調(diào)脂、抗氧化、改善心臟功能等多種功效，尤其在心腦血管疾病方面的防治作用以及調(diào)血脂、抗衰老等作用，使之愈來愈受到廣大醫(yī)藥工作者的關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，山楂葉總黃酮能明顯降血糖、調(diào)血脂，下調(diào)IGF-1 和IGFBP-3 的表達(dá)，改善腎臟功能。高血糖、IGFBP-3 的表達(dá)增多、糖尿病腎病時的腎小球系膜損傷等因素都可以明顯增加腎臟IGF-1 的水平，進(jìn)而導(dǎo)致糖尿病腎病的發(fā)生。山楂葉總黃酮可通過下調(diào)IGF-1 及IGFBP-3 的表達(dá)，減緩糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展。其機(jī)制可能為:①通過降糖作用改善氧化還原系統(tǒng)功能，減少機(jī)體IGF-1 的過度合成;②通過降糖作用抑制腎臟成纖維細(xì)胞和腎小球系膜細(xì)胞IGF-1 的高表達(dá);③通過降糖作用抑制系膜細(xì)胞分泌大量的NO，改善腎小球血流動力學(xué)變化，減輕腎小球的髙濾過;④通過減輕腎小球系膜損傷，從而抑制腎臟局部代償性合成IGF-1 并恢復(fù)其降解功能，使IGF-1 水平下降;⑤通過降低IGFBP-3 的表達(dá)，抑制由IGFBP-3 刺激腎臟局部合成IGF-1 的增多。但山楂葉總黃酮能下調(diào)IGFBP-3 表達(dá)的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

總之，盡管糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，但I(xiàn)GF-1 和IGFBP-3 在STZ-糖尿病腎病腎組織中的蓄積無疑會導(dǎo)致糖尿病腎病的發(fā)生。因此，有效調(diào)控IGF-1 及IGFBP-3 的表達(dá)，為防治糖尿病腎病提供了新的思路。山楂葉總黃酮可通過降糖、調(diào)脂、下調(diào)IGFBP-3 水平等作用，降低IGF-1 的表達(dá)，從而改善STZ-糖尿病腎病的腎功能減退，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步完善。

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