中藥多糖定量測(cè)定方法的探討

郭志燁， 韓 麗* ， 楊 明，2* ， 劉李梅， 鄒文銓

(1. 成都中醫(yī)藥大學(xué) 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都611137;2. 江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330004;3. 四川大學(xué)，四川成都610064)

1 引言

20 世紀(jì)60 年代，多糖作為光譜免疫促進(jìn)劑引起人們極大興趣［1］。經(jīng)過幾十年的研究發(fā)現(xiàn)從植物中提取的多糖參與了生物體中細(xì)胞的多種活動(dòng)，具有非常重要與特殊的生理活性，如免疫促進(jìn)、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗凝血、降血糖、降血脂、抗疲勞、抗衰老等［2］。其中人參多糖、枸杞多糖、靈芝多糖等都已被證明有顯著的藥效且無細(xì)胞毒性［3-8］。目前多糖測(cè)定方法有比色法(包括苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法等)、滴定法(包括間接碘量法等)、高效液相色譜法、氣相色譜法、薄層掃描法、高效毛細(xì)管電泳法等，以前3 種方法最為常用。檢索《中國(guó)藥典》2010 年版發(fā)現(xiàn)有8 種藥材收錄了多糖測(cè)定方法，即玉竹、云芝、枸杞子、鐵皮石斛、黃精、金櫻子、靈芝、蜂蜜。本文擬通過對(duì)較常用的前7 種藥材(除蜂蜜外)定量測(cè)定方法的分析，探討藥典中多糖測(cè)定方法存在的問題以及解決方法，以期為更多種中藥多糖的定量測(cè)定方法的選擇提供依據(jù)。

2 玉竹等7 味藥材多糖性質(zhì)及《中國(guó)藥典》中定量測(cè)定方法的分析

對(duì)7 種藥材的多糖性質(zhì)和收錄于《中國(guó)藥典》中的定量測(cè)定方法總結(jié)結(jié)果見表1。

表1 多糖性質(zhì)與測(cè)定方法總結(jié)

多糖按單糖的組成可分為均多糖和雜多糖［9］。已有研究表明玉竹等7 種藥材多糖均為雜多糖［10-18］。由表1 可知此7 種多糖定量測(cè)定方法包括苯酚-硫酸比色法、蒽酮-硫酸比色法和間接碘量法。比色法原理是多糖在硫酸的作用下水解成的單糖分子迅速脫水生成糖醛衍生物，后者能與苯酚或蒽酮縮合成有色化合物，在適當(dāng)波長(zhǎng)下和一定濃度范圍內(nèi)，該有色化合物的吸光度值與糖濃度呈線性關(guān)系，從而可比色測(cè)定多糖量［19］。其中苯酚-硫酸法顯色穩(wěn)定、靈敏度較高、受其他碳水化合物和蛋白質(zhì)干擾較小，在此3 種方法中應(yīng)用最為普遍［20-21］。蒽酮-硫酸法簡(jiǎn)便、快速，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性、穩(wěn)定性和重復(fù)性均優(yōu)于苯酚-硫酸法［22-23］。間接碘量法是分別用間接碘量滴定法測(cè)定總糖和單糖量，多糖量以無水葡萄糖計(jì)，為總糖量減去單糖量，本方法能在一定程度上排除還原性物質(zhì)的干擾，且快速，不需精密儀器。藥典中隨著藥材的不同選用的多糖提取方法、定量測(cè)定方法以及具體操作條件都稍有不同。

3 《中國(guó)藥典》中多糖定量測(cè)定方法存在的問題

3.1 多糖的提取分離純化問題與雜質(zhì)干擾問題 《中國(guó)藥典》中多糖一般采用熱水提取乙醇除雜，缺少進(jìn)一步分離純化的步驟，所以得到的多糖中往往含有影響定量測(cè)定的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、單糖、色素、苷等［2］。單糖類雜質(zhì)直接與苯酚或蒽酮反應(yīng)使實(shí)測(cè)值偏高;蛋白質(zhì)、苷類雜質(zhì)在酸性環(huán)境中水解后與苯酚或蒽酮反應(yīng)使實(shí)測(cè)值偏高［24-25］;色素類雜質(zhì)使待測(cè)樣品本身帶有顏色從而影響測(cè)定結(jié)果，比如苯酚-硫酸法中顯色物質(zhì)為橙黃色，如果樣品溶液也為橙黃色，則比色極易受到干擾使實(shí)測(cè)值偏高［26］。多糖中的雜質(zhì)會(huì)造成其測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確，而《中國(guó)藥典》中在對(duì)多糖進(jìn)行定量測(cè)定之前并沒有提到雜質(zhì)和純度檢查。

3.2 設(shè)備問題 傳統(tǒng)比色法的檢測(cè)設(shè)備分光光度計(jì)每次至多能測(cè)3 個(gè)樣品，存在操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)事、可比性與重復(fù)性差等缺陷，當(dāng)待測(cè)多糖樣品較多時(shí)缺陷尤為明顯［27］。

3.3 測(cè)定值與真實(shí)值之間存在偏差的問題 此7 種藥材多糖均為雜多糖，由不同的單糖縮合而成。在比色法中相同濃度的不同單糖如葡萄糖、果糖和半乳糖等所做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線是不重合的，即同一樣品用不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)得的含量值是不同的［28-29］。在間接碘量法中相同體積的碘滴定液相當(dāng)于不同單糖的量是不同的，即同一樣品以不同單糖計(jì)算所得含有量值也是不同的。所以對(duì)于雜多糖而言，測(cè)定值與真實(shí)值之間總是有差別的。

4 解決思路及方法

4.1 多糖的提取分離純化問題與雜質(zhì)干擾問題的解決 對(duì)于還原性雜質(zhì)的干擾一般通過先分別測(cè)定總糖和單糖，再用總糖量減去單糖量的方法排除，但是這種方法不能從根本上解決雜質(zhì)干擾問題。因?yàn)榇藛栴}產(chǎn)生的主要原因是提取分離純化方法過于簡(jiǎn)單，不能除去多糖中的雜質(zhì)。要達(dá)到多糖定量測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確的目的，需要做好多糖的提取分離純化、雜質(zhì)檢查、純度鑒別的前期工作，在得到無雜質(zhì)純度高的多糖的基礎(chǔ)上再依據(jù)其特點(diǎn)選擇不同的定量測(cè)定方法。大部分中藥多糖在提取前首先應(yīng)經(jīng)過預(yù)處理，即除脂溶性成分、單糖、色素等雜質(zhì)，然后采用熱水回流法得到提取液，再對(duì)提取液進(jìn)行除蛋白處理，最后經(jīng)過一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇沉淀即得到精制粗多糖(多糖類復(fù)合物)［30］。當(dāng)定量測(cè)定要求不高時(shí)，精制粗多糖可以直接通過酸水解后用比色法進(jìn)行測(cè)定;當(dāng)定量測(cè)定要求較高時(shí)，精制粗多糖需經(jīng)過分級(jí)沉淀、柱色譜、透析等方法分離純化后獲得純多糖［31］。無論是精制粗多糖還是純多糖，按單糖的組成都可分為均多糖和雜多糖，中藥多糖普遍為雜多糖。在進(jìn)行定量測(cè)定之前，對(duì)于粗多糖，需經(jīng)過雜質(zhì)檢查。對(duì)于純多糖，除了雜質(zhì)檢查外還需進(jìn)行純度檢查及相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定［32］。

4.2 設(shè)備問題和測(cè)量值與真實(shí)值偏差問題的解決 蒽酮-硫酸法和苯酚-硫酸法測(cè)定多糖量已應(yīng)用多年。在測(cè)定復(fù)雜的糖類化合物時(shí)，雖然存在以上問題，但這兩種經(jīng)典方法仍有其簡(jiǎn)便且較為準(zhǔn)確的特點(diǎn)。測(cè)定時(shí)可以本著簡(jiǎn)便、易行、準(zhǔn)確的原則，根據(jù)待測(cè)多糖性質(zhì)以及實(shí)驗(yàn)條件對(duì)傳統(tǒng)比色法進(jìn)行改良，從而解決多糖定量測(cè)定中存在的問題。此外高效液相色譜法、氣相色譜法、毛細(xì)管電泳法等方法中精密儀器的應(yīng)用也能提高中藥多糖測(cè)定的準(zhǔn)確性。

4.2.1 改良比色法

4.2.1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備的改良 對(duì)于設(shè)備問題可以尋找一種與分光光度計(jì)原理相同但是分析效率更高的儀器來代替。滿足此要求的是酶標(biāo)儀，酶標(biāo)儀與分光光度計(jì)均是采用光譜學(xué)朗伯-比耳定律，測(cè)定的都是樣品的吸光度，但是前者具有高通量檢測(cè)分析即一次性上樣量能達(dá)到數(shù)十至數(shù)百個(gè)樣品的優(yōu)勢(shì)，可保證各待測(cè)樣品測(cè)定條件的一致性［33］。楊定清等［34］利用酶標(biāo)儀實(shí)現(xiàn)了快速、可比性與重復(fù)性較好的香菇多糖定量測(cè)定。趙艷等［35］利用酶標(biāo)儀測(cè)定6 種食用菌中多糖量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明酶標(biāo)法具有良好的線性范圍，較高的穩(wěn)定性、可重復(fù)性和精密度，可以完全代替紫外可見分光光度計(jì)用于多糖的測(cè)定，同時(shí)使實(shí)驗(yàn)更為快捷、簡(jiǎn)便、節(jié)約。

4.2.1.2 單糖組分比例明確且簡(jiǎn)單的雜多糖定量測(cè)定方法的改良 檢測(cè)設(shè)備的改進(jìn)能在一定程度上提高多糖定量測(cè)定的準(zhǔn)確性，但仍然不能從根本上解決傳統(tǒng)比色法的不足即雜多糖以葡萄糖作對(duì)照品計(jì)算造成的偏差。隨著研究的深入，目前大部分雜多糖通過前期的單糖組分研究能明確單糖組成比，針對(duì)此類多糖，可以用相應(yīng)的單糖按組成比配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液來代替葡萄糖做標(biāo)準(zhǔn)曲線。林穎等［28］研究表明對(duì)于牛膝多糖等雜多糖，以某種單糖(如葡萄糖)為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定值總與真實(shí)值有差別。而以接近其實(shí)際單糖組成比配制成的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液來進(jìn)行測(cè)定，所得結(jié)果既符合事實(shí)又有較好的重復(fù)性。

4.2.1.3 單糖組分比例明確但復(fù)雜的雜多糖定量測(cè)定方法的改良 中藥多糖種類繁多，同樣是雜多糖，有些多糖由少數(shù)幾種比例明確的單糖聚合而成，其定量測(cè)定可參照“4.2.1.2”項(xiàng)下，而有些雜多糖中單糖組分比例明確但是種類較多。對(duì)于后者配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液較繁瑣且容易產(chǎn)生人為誤差，可以借鑒董群等［36］的研究，分別用各種單糖對(duì)照品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到斜率ki，由此計(jì)算各種單糖的校正系數(shù)k'i，即它們對(duì)葡萄糖的相對(duì)斜率，然后用下式計(jì)算該多糖校正系數(shù)，k' = ∑ik'i× awi，其中awi為組成單糖i 的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。應(yīng)用此系數(shù)就可以以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定組成已知的雜多糖量，并得到正確結(jié)果。

4.2.1.4 單糖組分不明確的雜多糖定量測(cè)定方法的改良混合單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和校正系數(shù)的計(jì)算都能提高多糖定量測(cè)定的準(zhǔn)確性，但是操作較繁瑣且要求多糖中單糖組成比明確，當(dāng)所測(cè)多糖前期研究基礎(chǔ)較為薄弱，單糖組成比不清楚時(shí)“4.2.1.2”、“4.2.1.3”項(xiàng)下改良比色法都不能應(yīng)用。對(duì)此問題的解決，既要遵循對(duì)照品與待測(cè)樣品結(jié)構(gòu)一致的原則，也要考慮多糖成分結(jié)構(gòu)復(fù)雜的事實(shí)。鑒于此兩點(diǎn)，可用待測(cè)多糖的精制多糖做對(duì)照品或者以其對(duì)葡萄糖計(jì)算換算因子后以葡萄糖做對(duì)照品，一方面能避免單純用葡萄糖做標(biāo)準(zhǔn)引起的系統(tǒng)誤差，另一方面較之用與雜多糖組成相同的混合單糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線或據(jù)雜多糖組成計(jì)算校正系數(shù)簡(jiǎn)便，而且由于組成上與待測(cè)樣品最接近，結(jié)果較真實(shí)［37-38］。此法也是目前研究中較多用的改良比色法。徐麗媛等［39］研究表明以精制多糖計(jì)算粗多糖對(duì)葡萄糖的換算因子，校正以往單獨(dú)以葡萄糖為對(duì)照測(cè)定多糖量的方法，使測(cè)定結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠。

4.2.2 高效液相色譜法 改良比色法能在一定程度上提高多糖定量測(cè)定的準(zhǔn)確性，但是仍存在穩(wěn)定性和選擇性較差的問題，且對(duì)儀器的靈敏度和操作者的實(shí)驗(yàn)技能要求較高［40］。國(guó)外自20 世紀(jì)70 年代以來，開始應(yīng)用凝膠排斥色譜測(cè)定蛋白質(zhì)等高分子有機(jī)化合物，隨著耐高壓填料的出現(xiàn)，高效凝膠排斥色譜法已逐步應(yīng)用在多糖定量測(cè)定上。HPLC 法不僅可以測(cè)定總的多糖類復(fù)合物的量，也能對(duì)某個(gè)具有特定相對(duì)分子質(zhì)量的組分進(jìn)行測(cè)定［41-42］，所以在實(shí)驗(yàn)條件允許的情況下，采用此法代替比色法，能解決多糖定量測(cè)定方法中存在的問題。

4.2.2.1 應(yīng)用于單糖組分比例明確的雜多糖的定量測(cè)定此法與比色法類似，都是以單糖為對(duì)照品，對(duì)多糖酸水解后進(jìn)行測(cè)定。但是因?yàn)镠PLC 法具有靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，使得多糖的定量測(cè)定更準(zhǔn)確。最近幾年的多糖HPLC 研究中普遍采用此法，如Yang 等［43］以5 種單糖為對(duì)照品，對(duì)水解后的靈芝多糖用HPLC 法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明該法簡(jiǎn)單、快速、靈敏高、重復(fù)性好，可用于靈芝多糖組成分析和定量測(cè)定。

4.2.2.2 應(yīng)用于相對(duì)分子質(zhì)量已知的特定多糖組分的定量測(cè)定 HPLC 法是多糖分離純化以及相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定方法中的一種，所以能在粗多糖的基礎(chǔ)上制備出純多糖，并計(jì)算出平均相對(duì)分子質(zhì)量。對(duì)于此類已知平均相對(duì)分子質(zhì)量的純多糖，應(yīng)遵循對(duì)照品與樣品結(jié)構(gòu)相似(相對(duì)分子質(zhì)量相近)的原則，以與其相對(duì)分子質(zhì)量相同的葡聚糖為對(duì)照品，用HPLC 法測(cè)定多糖量［44］。韓振泰等［45］選用與靈芝多糖保留時(shí)間相近的相對(duì)分子質(zhì)量為104的葡聚糖為對(duì)照品，采用HPLC 法對(duì)靈芝多糖進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明該方法是一種準(zhǔn)確性好、精密度高的靈芝多糖定量測(cè)定方法。

同樣被稱為靈芝多糖，同樣應(yīng)用HPLC 法，但是可以根據(jù)其性質(zhì)的不同選擇以上兩種不同的方法。HPLC 法與其他方法比較具有分離效能高、選擇性強(qiáng)、靈敏度高、使用方便、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，雖然目前沒有錄入《中國(guó)藥典》，但是越來越多的研究表明此法應(yīng)用前景較大，是一種值得推廣采用的方法。比如在新藥研發(fā)中，對(duì)于以粗多糖為研究對(duì)象的新藥，在前期的工作中應(yīng)將主要多糖進(jìn)行分離后分別進(jìn)行藥理實(shí)驗(yàn)，然后在質(zhì)量控制中可以以其中一個(gè)藥效強(qiáng)的多糖組分作為質(zhì)控指標(biāo)用HPLC 來檢測(cè)。對(duì)于以純多糖為研究對(duì)象的新藥，由于多糖的相對(duì)分子質(zhì)量與多糖活性有很大關(guān)系，在用HPLC 進(jìn)行定量測(cè)定之前，必須用HPLC 測(cè)定其相對(duì)分子質(zhì)量及相對(duì)分子質(zhì)量分布［29］。陳蕓蕓等［46］通過用HPLC 法對(duì)太子神悅膠囊中多糖的相對(duì)分子質(zhì)量分布進(jìn)行測(cè)定后，選擇相對(duì)分子質(zhì)量與樣品相近的葡聚糖Dextrans T-15 為對(duì)照品，用面積歸一化法計(jì)算各組分量。結(jié)果顯示太子神悅膠囊中相對(duì)分子質(zhì)量為17.0 × 103～27.0 × 103的多糖 (JNTP2)的含有量為(0.805 ±0.01)%，此項(xiàng)研究建立了簡(jiǎn)便、快捷、精密度高的色譜方法，較為準(zhǔn)確地測(cè)定了太子神悅膠囊中多糖的含有量和相對(duì)分子質(zhì)量分布，為制定太子神悅膠囊多糖的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

4.2.3 其他方法 多糖定量測(cè)定除了上述3 種較常用的方法外，還有氣相色譜法、高效毛細(xì)管電泳法、薄層掃描法。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，它們作為新的技術(shù)應(yīng)用于多糖定量測(cè)定，并取得了一定的進(jìn)展［47-50］。但是因?yàn)樵O(shè)備少技術(shù)難等原因還沒有得到普遍應(yīng)用，且各自的優(yōu)缺點(diǎn)和應(yīng)用范圍也有待進(jìn)一步研究。

5 結(jié)語

隨著中藥多糖研究的深入，其定量測(cè)定方法中存在問題的解決迫在眉睫。通過以上分析，發(fā)現(xiàn)多糖定量測(cè)定的準(zhǔn)確性是建立在多糖的提取、分離純化、雜質(zhì)檢查、純度鑒別、組分分析等一系列前期工作的基礎(chǔ)上的。要想得到準(zhǔn)確的多糖測(cè)定結(jié)果，需要選擇合適的分離純化方法并經(jīng)過雜質(zhì)檢查、純度檢查證明是純多糖后，再根據(jù)其性質(zhì)以及實(shí)驗(yàn)條件選擇適宜的定量測(cè)定方法。雖然目前部分中藥多糖得到了較系統(tǒng)的研究，但是仍有很多種類的中藥多糖因組成成分較多及結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，研究尚不充分，這也對(duì)其定量測(cè)定造成了困難。同時(shí)因?yàn)槎嗵鞘墙Y(jié)構(gòu)性質(zhì)特殊的大分子物質(zhì)，它的每一步研究都具有特殊性以及前后關(guān)聯(lián)性，所以多糖定量測(cè)定不是一個(gè)獨(dú)立的研究?jī)?nèi)容，應(yīng)該與其他方面的研究相結(jié)合，這也是今后每個(gè)研究多糖的工作者應(yīng)該注意的方面。

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