柱前衍生HPLC 法分析蔓菁多糖中單糖的組成

鄺婷婷， 王 宇， 王 張 ， 楊永東， 張 藝

(成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，四川 成都611137)

蔓菁為十字花科蕓薹屬植物蕪菁Brassica rapa L. 的干燥塊根，味甘，性溫，能祛風(fēng)、生赤巴、滋補(bǔ)、解毒，治培根病、龍病、身體虛弱、中毒?。?-2］?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，蔓菁提取物具有抗缺氧、提高免疫力、抗輻射等活性［3-8］。多糖是一類免疫活性物質(zhì)，具有提高免疫能力的作用，廣泛存在于植物中。前期藥理實驗證明，蔓菁多糖具有緩解小鼠體力疲勞和提高耐缺氧能力的作用［9］。因此，本實驗采用柱前衍生化反相高效液相色譜法對蔓菁多糖進(jìn)行單糖組成方面的研究，旨在為蔓菁多糖藥理活性方面的深入研究和保健品深度開發(fā)提供可靠依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1200 型HPLC 色譜儀，Agilent Chemstaiton 工作站(美國Agilent 公司);HK-04B型中藥粉碎機(jī)(廣州華凱機(jī)電設(shè)備有限公司);TDZ5-WS 多管架自動平衡離心機(jī)(湘南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司);Sartorius BP121s 電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);超純水器(ULUP-1-10T 型，成都超純科技有限公司)，超聲波清洗器(CQ-250 型，上海必能信公司);Finnpipette 白色微量移液器(熱電上海公司);尼龍有機(jī)濾頭(0.45 μm，津騰公司);Labconco FreeZone冷凍干燥儀(美國LABCONCO 公司)。

1.2 材料 蔓菁藥材來源于四川省白玉縣章都鄉(xiāng)馬拉村，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院張藝研究員鑒定為十字花科蕓薹屬植物蕪菁Brassica rapa L.的干燥塊根。半乳糖、D-甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、D-無水葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸對照品純度均在99.0%以上，購于中國藥品生物制品檢定檢驗所;1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)為分析純，購于成都市科龍化工試劑廠;苯酚、95%乙醇、濃硫酸為分析純，購自成都市科龍化工儀器廠;水為實驗室自制去離子水;乙腈、磷酸為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 參照文獻(xiàn)［10-11］的方法，略有改進(jìn)。Kromasil C18色譜柱 (250 mm × 4.6 mm，5 μm);乙腈為A 流動相，0.1 mol/L 磷酸鹽(KH2PO4-NaOH，pH 6.8)緩沖液為B 流動相，梯度洗脫(0 ～10 min，16%A;10 ～30 min，16% ～18%A;30 ～50 min，18% ～19% A);檢測波長250 nm;體積流量1.0 mL/min;進(jìn)樣量10 μL;柱溫30 ℃。

2.2 蔓菁多糖的提取 蔓菁樣品干燥粉碎(過三號篩)，取粉末約6 g，精密稱定，加80%乙醇回流提取2 次，濾渣晾干，加30 倍量水，90 ℃水浴回流提取3 次，每次2 h，合并濾液，濃縮至料液比1 ∶1，加乙醇使乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，靜置24 h。離心棄去上層清液，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌至無色，再加水復(fù)溶，復(fù)溶液中加相當(dāng)于其體積1/4 的sevag 試劑，劇烈振搖，離心，取上層清液再加相當(dāng)于其體積1/4 的sevag試劑，重復(fù)以上操作直到無白色絮狀物產(chǎn)生為止;所得上層清液，加3% 的活性炭，60 ℃吸附40 min，濾過，離心，取上層清液，濃縮，真空冷凍干燥，即得蔓菁多糖。

2.3 溶液的制備

2.3.1 供試品溶液 取蔓菁多糖約20 mg，精密稱定，置20 mL 具塞試管中，加2 mol/L 硫酸溶液

2.0 mL，在沸水浴中水解8 h，用8 mol/L NaOH 中和至約pH 7，用水稀釋至5 mL，離心，收集上層清液，即得。

2.3.2 對照品溶液 分別稱取半乳糖、D-甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、D-無水葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸對照品適量，精密稱定，置10 mL量瓶中用水溶解并定容至刻度，搖勻，配制成含半乳糖791 μmol/L、D-甘露糖500 μmol/L、鼠李糖305 μmol/L、阿拉伯糖1 316 μmol/L、D-無水 葡 萄 糖1 124 μmol/L、D-葡 萄 糖 醛 酸 155 μmol/L、D-半乳糖醛酸1 198 μmol/L 的對照品溶液，備用。

2.4 衍生化產(chǎn)物的制備 參照文獻(xiàn)［12-13］的方法，略有改進(jìn)。將單糖對照品、混合對照品溶液及蔓菁多糖水解樣品溶液各取200 μL 分別置于10 mL離心管中，然后向其依次加0.5 mol/L PMP 甲醇溶液各200 μL 和0.3 mol/LNaOH 溶液200 μL，混勻后置于70 ℃水浴中加熱反應(yīng)30 min，取出放置至室溫;再加0.3 mol/L 鹽酸溶液200 μL 中和，混勻后加1 mL 三氯甲烷渦旋混合，靜置，棄去下層液，重復(fù)3 次，上層液過0.45 μm 微孔濾膜，取10 μL 進(jìn)樣，進(jìn)行HPLC 分析。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系 分別精密吸取上述混合對照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、10.0 mL，置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為系列對照品混合溶液。按“2.4”項下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。以對照品濃度(X)為橫坐標(biāo)，色譜峰峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。

表1 7 種單糖衍生產(chǎn)物的線性關(guān)系Tab.1 Linear relationship for precolumn derivation product of seven monosaccharide

2.5.2 精密度試驗 取對照品混合溶液，按“2.4”項下進(jìn)行衍生化，依照“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，測定半乳糖、D-甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、D-無水葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸峰面積的RSD 分別為0.5%、0.6%、0.5%、0.4%、0.5%、0.3%和1.1%。

2.5.3 重復(fù)性試驗 取蔓菁多糖6 份，按“2.3”項下操作制備溶液，再按“2.4”項下方法進(jìn)行衍生化處理，在“2.1”項色譜條件下，進(jìn)行測定，記錄峰面積，計算半乳糖、D-甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、D-無水葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸含有量的RSD 分別為1.3%、1.1%、1.7%、1.9%、1.7%、1.2%和0.8%。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗 取蔓菁多糖，按“2.3”項下操作制備溶液，再按“2.4”項下方法進(jìn)行衍生化處理，分別于衍生化反應(yīng)結(jié)束后0、2、4、8、16 和24 h 進(jìn)樣，記錄峰面積，結(jié)果表明樣品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定，半乳糖、D-甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、D-無水葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸峰面積的 RSD 分別為1.2%、1.3%、1.4%、1.3%、1.8%、1.7%和1.2%。

2.5.5 加樣回收率試驗 取已知含有量的蔓菁多糖約0.01 g，共6 份，精密稱定，置具塞試管中，分別精密加入不同量的半乳糖、D-甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、D-無水葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸對照品適量，按“2.3.1”項下操作制備溶液，再按“2.4”項下方法進(jìn)行衍生化處理，在“2.1”項色譜條件下，進(jìn)行測定，結(jié)果見表2 ～表8。

表2 半乳糖加樣回收試驗結(jié)果Tab.2 Results of recovery tests for galactose

2.6 樣品測定 取蔓菁多糖6 份，按“2.3”項下操作制備溶液，再按“2.4”項下方法進(jìn)行衍生化處理，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)行測定，記錄峰面積。根據(jù)分析和計算，求得蔓菁多糖中半乳糖、D-甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、D-無水葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸摩爾比為1 ∶0.26 ∶0.54 ∶1.06 ∶0.84 ∶0.05 ∶4.17，色譜圖見圖1。

表3 D-甘露糖加樣回收試驗結(jié)果Tab.3 Results of recovery tests for mannose

表4 鼠李糖加樣回收試驗結(jié)果Tab.4 Results of recovery tests for rhamnose

表5 阿拉伯糖加樣回收試驗結(jié)果Tab.5 Results of recovery tests for arabincose

表6 D-無水葡萄糖加樣回收試驗結(jié)果Tab.6 Results of recovery tests for glucose

表7 D-葡萄糖醛酸加樣回收試驗結(jié)果Tab.7 Results of recovery tests for glucuronic acid

表8 D-半乳糖醛酸加樣回收試驗結(jié)果Tab.8 Results of recovery tests for galacturonic acid

圖1 對照品(A)與樣品衍生產(chǎn)物(B)色譜圖Fig.1 Chromatograms of standards (A)and sample precolumn derivation products (B)

3 討論

3.1 多糖水解時間的選擇 本實驗考察了蔓菁多糖完全水解所需時間及不同水解時間內(nèi)單糖摩爾比的變化趨勢。結(jié)果表明，水解2、4、6、8 h 所得到的7 種單糖摩爾比呈上升趨勢，水解8 h 和10 h所得到的7 種單糖摩爾比是一致的，故選擇水解時間是8 h。

3.2 衍生化條件的影響 從對照品與樣品衍生產(chǎn)物色譜圖可知，衍生化后的雜質(zhì)峰出現(xiàn)在20 min之前，可與各個單糖衍生物的峰很好地分離，不影響單糖組分的測定。由1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)的空白實驗可知，殘留的PMP 峰出在17.5 min，可與各個單糖很好地分離，其殘留不影響單糖的測定。

3.3 本實驗采用PMP 柱前衍生化HPLC 法分析蔓菁多糖中各單糖組分，結(jié)果表明蔓菁多糖由半乳糖、D-甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、D-無水葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸7 種單糖組成，其摩爾比為1 ∶0.26 ∶0.54 ∶1.06 ∶0.84 ∶0.05 ∶4.17。其中半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖的摩爾比含有量明顯高于葡萄糖醛酸、葡萄糖、甘露糖、鼠李糖，其摩爾比百分比達(dá)到78.7%，說明蔓菁多糖主要由半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖構(gòu)成，其中半乳糖醛酸的摩爾比最大。由此可見，半乳糖醛酸在蔓菁多糖中含有量最高。

本實驗建立的PMP 柱前衍生化高效液相色譜法分析單糖的方法準(zhǔn)確可靠，可同時檢測7 個單糖，且分離效果理想，適合于蔓菁多糖樣品的單糖組成測定，所得到的結(jié)果從側(cè)面反映了蔓菁多糖的結(jié)構(gòu)。

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