HPLC 法測定肝友膠囊中的槲皮素、木犀草素、對羥基苯乙酮、濱蒿內酯和白藜蘆醇

譚雄斯， 曹娟娟

(肇慶醫(yī)學高等?？茖W校，廣東 肇慶526020)

肝友膠囊為中藥復方制劑，源于衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑第十一冊，由火炭母、茵陳、虎杖、丹參、雞骨草、茯苓、山楂、郁金、澤瀉、神曲茶、雞爪芋、白背葉根、黨參、蠶砂、白術等十五味藥物組成。具有清熱利濕、疏肝解郁、活血化瘀、健脾導滯的功效，可用于急性、遷延性及慢性病毒性肝炎諸癥的治療［1-3］。原質量標準僅對方中丹參和虎杖進行了顯微鑒別，未對方中藥味的主要成分進行定量測定，不能有效地控制產品的質量和療效。火炭母、茵陳和虎杖為方中主要藥物，火炭母具有清熱利濕、涼血解毒的功效，可用于濕熱泄瀉、痢疾，黃疸，咽喉腫痛，濕熱瘡疹等癥的治療;茵陳具有清利濕熱、利膽退黃的功效，可用于黃疸尿少，濕溫暑濕，濕瘡瘙癢等癥的治療;虎杖具有利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛、止咳化痰的功效，可用于濕熱黃疸，淋濁，帶下，風濕痹痛，癰腫瘡毒，水火燙傷，經閉，癓瘕，跌打損傷，肺熱咳嗽等癥的治療。同時槲皮素和木犀草素為火炭母主要成分，對羥基苯乙酮和濱蒿內酯為茵陳主要成分，白藜蘆醇為虎杖主要成分，本實驗采用高效液相梯度洗脫法對火炭母中槲皮素、木犀草素和茵陳中對羥基苯乙酮、濱蒿內酯以及虎杖中的白藜蘆醇進行測定方法研究，為完善該制劑質量標準提供依據(jù)，能有效控制產品的內在質量，確保人民用藥安全有效。

1 試藥與儀器

高效液相色譜儀(日本島津LC-10ATVP 型，島津自動進樣器SIL-10ADVP);ANASTAR 色譜數(shù)據(jù)工作站;SPD-1OAVP 型紫外可見檢測器(日本島津公司);槲皮素(批號100081-200907，純度96.5%)、木犀草素(批號111520-200504)、對羥基苯乙酮(批號111897-201001)、濱蒿內酯(批號111511-201102，純度97.2%)和白藜蘆醇(批號111535-200502)對照品均來源于中國食品藥品檢定研究院;肝友膠囊(每粒裝0.3 g;產品批號分別為130713，130718，130725)購于廣東益和堂制藥有限公司;磷酸(分析純，廣州化學試劑二廠);冰醋酸(色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司);甲醇、乙腈(色譜純，天津市康科德科技有限公司)。

2 方法與結果

2.1 槲皮素和木犀草素的測定［4-14］

2.1.1 色譜條件 Hypersil C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);柱溫為室溫;流動相A 為甲醇-乙腈(4 ∶1)，流動相B 為0.6%磷酸溶液，梯度洗脫(0 ～15 min，25% A;15 ～30 min，25% →60%A;30 ～40 min，60%A);檢測波長360 nm;體積流量0.7 mL/min。在此條件下槲皮素和木犀草素與其他組分分離效果良好，以木犀草素計理論塔板數(shù)應不低于2 500。

2.1.2 檢測波長的選擇 分別取槲皮素對照品和木犀草素對照品適量，加甲醇-乙腈-0.6%磷酸溶液(40 ∶10 ∶50)溶解，制備成0.05 mg/mL 的溶液，紫外掃描波長范圍定為200 ～400 nm，結果在360 nm 處槲皮素對照品和木犀草素對照品均有最大吸收，故將槲皮素和木犀草素的檢測波長定為360 nm。

2.1.3 供試品溶液的配制 取本品適量，傾出內容物，研細，取約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇-乙腈(4 ∶1)50 mL，稱定質量，采用超聲波(300 W，30 kHz)超聲提取20 min，用甲醇-乙腈(4 ∶1)補足減失質量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 混合對照品溶液的配制 分別精密稱取槲皮素對照品和木犀草素對照品各適量，置具塞錐形瓶中，加甲醇-乙腈(4 ∶1)制成混合對照品溶液(槲皮素為0.019 6 mg/mL，木犀草素為0.010 2 mg/mL)。

2.1.5 陰性對照試驗 按肝友膠囊處方比例稱取除火炭母的其余藥味，按肝友膠囊的生產工藝分別制成缺火炭母的陰性樣品，按照上述供試品溶液的配制方法制成缺火炭母的陰性供試品溶液。分別精密吸取10 μL 的供試品溶液、混合對照品溶液和缺火炭母的陰性供試品溶液，按上述方法測定，結果在與槲皮素和木犀草素對照品色譜圖相應的保留時間處，供試品溶液色譜圖中有吸收峰，而陰性樣品色譜圖中未顯吸收峰，色譜圖見圖1。

圖1 槲皮素和木犀草素的HPLC 圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of quercetin and luteolin

2.1.6 線性關系考察 精密吸取“2.1.4”項下混 合 對 照 品 溶 液 1、5、10、15、20 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進行測定，以峰面積積分值Y 為縱坐標，各組分進樣量X 為橫坐標分別繪制標準曲線，得回歸方程為:槲皮素Y = 4.127 6 ×106X-368.9，r=0.999 1;木犀草素Y=2.964 3 ×106X-638.1，r =0.999 4。槲皮素和木犀草素分別在0.019 6 ～0.392 0 μg、0.010 2 ～0.204 0 μg進樣量與峰面積具有良好線性關系。

2.1.7 精密度試驗 取“2.1.4”項下混合對照品溶液，按照“2.1.1”項下所述色譜條件，重復進樣6 次，測定，記錄槲皮素和木犀草素的峰面積，試驗結果表明，儀器具有良好的精密度，槲皮素和木犀草素的RSD 分別為0.7%、0.5%。

2.1.8 重復性試驗 取同一批樣品(產品批號130713)，按“2.1.3”項下所述方法制備6 份供試品溶液，分別測定，求得各組分RSD，槲皮素和木犀草素的RSD 分別為0.7%、0.8%。結果表明本法測定具有良好的重復性。

2.1.9 穩(wěn)定性考察 取上述同一供試品溶液(產品批號130713)，分別在室溫下放置0、1、2、4、6、8 h 后進樣10 μL，測定其峰面積值，槲皮素和木犀草素的RSD 分別為0.5%、0.4%，表明供試品溶液8 h 內基本穩(wěn)定。

2.1.10 加樣回收率試驗 取已知含有量(槲皮素0.52 mg/g、木犀草素0.24 mg/g)的同一批樣品(批號130713)適量，傾出內容物，研細，取約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入對照品混合溶液25 mL、甲醇-乙腈 (4 ∶1)25 mL，按“2.1.3”項制備加樣供試品試液，測定，計算，結果見表1。

表1 槲皮素和木犀草素的加樣回收率Tab.1 Results of recovery tests for quercetin and luteolin

2.2 對羥基苯乙酮和濱蒿內酯的測定［15-22］

2.2.1 色譜條件 Hypersil C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);柱溫為室溫;流動相A 為乙腈，流動相B 為0.3% 乙酸溶液，梯度洗脫 (0 ～13 min，37.0% A;13 ～38 min，37.0% →53.0%A;38 ～50 min，53.0%A);檢測波長278 nm;體積流量0.7 mL/min。在此條件下對羥基苯乙酮和濱蒿內酯與其他組分基線分離良好，以對羥基苯乙酮計理論塔板數(shù)應不低于3 000。

2.2.2 檢測波長的選擇 分別取對羥基苯乙酮和濱蒿內酯對照品適量，加55%甲醇溶解，制備成0.10 mg/mL 的溶液，紫外掃描波長范圍定為200 ～400 nm，結果對羥基苯乙酮和濱蒿內酯對照品分別在277 nm、279 nm 處有最大吸收，故綜合考慮將對羥基苯乙酮和濱蒿內酯檢測波長定為278 nm。

2.2.3 供試品溶液的配制 取本品適量，傾出內容物，研細，稱取約2.0 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入55%甲醇50 mL，稱定質量，超聲處理 (功率300 W，頻率50 kHz)30 min，用55%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.4 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取對羥基苯乙酮和濱蒿內酯對照品各適量，置50 mL 具塞錐形瓶中，加55%甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液 (對羥基苯乙酮為0.037 6 mg/mL 和濱蒿內酯0.192 4 mg/mL)。

2.2.5 陰性對照試驗 按肝友膠囊處方比例稱取除茵陳的其余藥味，按肝友膠囊的生產工藝分別制成缺茵陳的陰性樣品，按照上述供試品溶液的配制方法制成缺茵陳的陰性供試品溶液。分別精密吸取10 μL 的供試品溶液、混合對照品溶液和缺茵陳的陰性供試品溶液，按上述方法測定，結果在與對羥基苯乙酮和濱蒿內酯對照品色譜圖相應的保留時間處，供試品溶液色譜圖中有吸收峰，而陰性樣品色譜圖中未顯吸收峰，色譜圖見圖2。

圖2 對羥基苯乙酮和濱蒿內酯的HPLC 圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of 4'-hydroxyacetophenone and scoparone

2.2.6 線性關系考察 精密吸取“2.2.4”項下混合 對 照 品 溶 液1、5、10、15、20 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進行測定，以峰面積積分值Y 為縱坐標，各組分進樣量X 為橫坐標分別繪制標準曲線，得回歸方程為:對羥基苯乙酮Y =2.035 7 × 106X + 567.1，r = 0.999 6;濱蒿內酯Y=5.351 4 ×106X-625.9，r=0.999 2。對羥基苯乙酮和濱蒿內酯分別在0.037 6 ～0.752 0 μg、0.192 4 ～3.848 μg 范圍內進樣量與峰面積線性關系良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取上述同一供試品溶液(產品批號130713)，分別在室溫下放置0、1、2、4、6、8 h 后進樣10 μL，測定其峰面積值，對羥基苯乙酮和濱蒿內酯RSD 分別為1.0%、0.7%。結果表明，供試品溶液8 h 內基本穩(wěn)定。

2.2.8 精密度試驗 取“2.1.4”項下混合對照品溶液，按照“2.2.1”項下色譜條件重復進樣6次，測定，記錄對羥基苯乙酮和濱蒿內酯的峰面積，試驗結果表明，儀器具有良好的精密度，對羥基苯乙酮和濱蒿內酯的RSD 分別為0.3%、0.8%。

2.2.9 重復性試驗 取上述同一批樣品(批號130713)，按“2.2.3”項下所述方法制備6 份供試品溶液，分別測定，求得各組分RSD，對羥基苯乙酮和濱蒿內酯的RSD 分別為0.9%、0.9%。結果表明本方法測定重復性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗 取已知含有量(對羥基苯乙酮0.96 mg/g、濱蒿內酯4.78 mg/g)的同一批樣品(批號130713)適量，剪碎，混勻，取約1.0 g，精密稱定，置50 mL 具塞錐形瓶中，分別精密加入對照品混合溶液25 mL，加50%甲醇稀釋至刻度，按“2.2.3”項制備加樣供試品溶液，測定，計算，結果見表2。

2.3 白藜蘆醇的測定［23-26］

2.3.1 色譜條件 Hypersil C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);柱溫為室溫;乙腈-水(30 ∶70)為流動相，體積流量0.7 mL/min，檢測波長302 nm。在此條件下白藜蘆醇及其他組分均達到基線分離，理論塔板數(shù)以白藜蘆醇計算應不低于2 000。

2.3.2 檢測波長的選擇 取白藜蘆醇對照品適量，加流動相溶解，并稀釋制成0.05 mg/mL 的溶液，紫外掃描波長范圍定為200 ～400 nm，結果白藜蘆醇在302 nm 處有最大吸收，故選用302 nm 作為白藜蘆醇的檢測波長。

表2 對羥基苯乙酮和濱蒿內酯加樣回收率Tab.2 Results of recovery tests for 4'-hydroxyacetophenone and scoparone

2.3.3 供試品溶液的配制 取樣品適量，傾出內容物，研細，取約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇50 mL，稱定質量，采用超聲波(300 W，30 kHz)超聲25 min，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3.4 對照品溶液的制備 精密稱取白藜蘆醇對照品適量，加甲醇制成0.071 4 mg/mL 的對照品溶液。

2.3.5 陰性對照試驗 按肝友膠囊處方比例稱取除虎杖的其余藥味，按肝友膠囊的生產工藝分別制成缺虎杖的陰性樣品，按照“2.3.3”項制成缺虎杖的陰性供試品溶液。分別精密吸取10 μL 的供試品溶液、混合對照品溶液和缺虎杖的陰性供試品溶液，按上述方法測定，結果在與白藜蘆醇對照品色譜圖相應的保留時間處，供試品溶液色譜圖中有吸收峰，而陰性樣品色譜圖中未顯吸收峰，色譜圖見圖3。

2.3.6 線性關系考察 分別精密吸取對照品溶液1、5、10、15、20 μL，按“2.3.1”項下色譜條件進行測定，以峰面積積分值Y 為縱坐標，各組分進樣量X 為橫坐標分別繪制標準曲線，得回歸方程為:Y=2.657 8 ×106X +513.7，r =0.999 3。白藜蘆醇在0.071 4 ～1.428 0 μg 進樣量與峰面積線性關系良好。

2.3.7 精密度試驗 取“2.3.4”項下混合對照品溶液，按照“2.3.1”項下所述色譜條件，重復進樣6 次，測定，記錄白藜蘆醇的峰面積，試驗結果表明，儀器具有良好的精密度，RSD 為0.8%。

圖3 白藜蘆醇的HPLC 圖譜Fig.3 HPLC chromatograms of resveratrol

2.3.8 穩(wěn)定性試驗 取上述同一供試品溶液(批號130713)，分別在室溫下放置0、1、2、4、6、8 h后進樣10 μL，測定其峰面積，考察樣品溶液的穩(wěn)定性，結果表明，供試品溶液8 h 內基本穩(wěn)定，白藜蘆醇RSD 為0.6%。

2.3.9 重復性試驗 取同一批樣品 (批號130713)，按“2.3.3”項制備6 份供試品溶液，分別測定，求得各組分RSD，結果表明本方法重復性較好，白藜蘆醇RSD 為0.7%。

2.3.10 加樣回收率試驗 取已知含有量(白藜蘆醇3.56 mg/g)的同一批樣品(批號130713)，傾出內容物，研細，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入對照品溶液25 mL、甲醇25 mL，按“2.3.3”項制備加樣供試品試液，測定，計算，結果見表3。

表3 白藜蘆醇回收率試驗Tab.3 Results of recovery tests for resveratrol

2.4 樣品測定 取3 批樣品按“2.1”項下槲皮素和木犀草素測定方法、 “2.2”項下對羥基苯乙酮和濱蒿內酯測定方法和“2.3”項下白藜蘆醇測定方法測定，各成分定量測定結果見表4。

表4 樣品測定結果(±s，n=3)Tab.4 Results of content determination (±s，n=3)

表4 樣品測定結果(±s，n=3)Tab.4 Results of content determination (±s，n=3)

批 號 槲皮素/(mg/粒) 木犀草素/(mg/粒) 對羥基苯乙酮/(mg/粒) 濱蒿內酯/(mg/粒) 白藜蘆醇/(mg/粒)1.434 ±0.010 1.068 ±0.011 130718 0.171 ±0.003 0.080 ±0.001 0.318 ±0.003 1.533 ±0.009 0.999 ±0.011 130725 0.163 ±0.003 0.085 ±0.002 0.334 ±0.004 130713 0.156 ±0.002 0.072 ±0.001 0.288 ±0.005 1.642 ±0.016 1.134 ±0.009

3 討論

3.1 對羥基苯乙酮和濱蒿內酯測定時曾分別采用甲醇-0.02%醋酸水溶液為流動相梯度洗脫、甲醇-0.4%磷酸為流動相梯度洗脫和乙腈-0.3%醋酸溶液為流動相梯度洗脫進行試驗，結果以甲醇-0.02%醋酸水溶液為流動相梯度洗脫時濱蒿內酯分離效果良好，但對羥基苯乙酮無法達到基線分離;以甲醇-0.4%磷酸為流動相梯度洗脫時對羥基苯乙酮分離效果好，但濱蒿內酯拖尾現(xiàn)象嚴重;以乙腈-0.3%醋酸溶液為流動相梯度洗脫時對羥基苯乙酮和濱蒿內酯均能達到基線分離，峰形較好。故選用乙腈-0.3%醋酸溶液為流動相梯度洗脫。

3.2 實驗中曾采用甲醇-乙腈(4 ∶1)與0.6%磷酸溶液、乙腈與0.3%醋酸溶液和乙腈-水為流動相以不同比例梯度洗脫同時測定以上5 種成分，以甲醇-乙腈(4 ∶1)與0.6%磷酸溶液為流動相不同比例梯度洗脫時，槲皮素和木犀草素能達到基線分離，而對羥基苯乙酮、濱蒿內酯和白藜蘆醇分離效果差，不能有效分離;以乙腈與0.3%醋酸溶液為流動相不同比例梯度洗脫時，槲皮素和木犀草素達不到有效分離，白藜蘆醇拖尾現(xiàn)象嚴重。故本實驗采用不同流動相對處方中的5 個主要成分進行了定量測定，以有效控制產品的質量。

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［2］ 國家藥典委員會. 國家藥品標準中藥成方制劑第十一冊［S］. 北京:人民衛(wèi)生出版社，1998:92.

［3］ 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典:1977 年版一部［S］. 北京:人民衛(wèi)生出版社，1978:122-123.

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