氣相色譜法同時測定重樓解毒酊中5 個成分

田紅紅， 乙 引， 柳立偉， 楊衛(wèi)靈， 伍 慶* ， 李 興

(1. 貴州師范大學(xué)，貴州 貴陽550001;2. 貴陽醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽550004)

重樓解毒酊是由重樓、石菖蒲、艾葉、艾片等六味藥材組成的苗藥，具有清熱解毒、散瘀止痛之功效。臨床用于治療肝經(jīng)火毒所致的帶狀皰疹，皮膚瘙癢，蟲咬皮炎，流行性腮腺炎等癥［1］。目前，關(guān)于重樓解毒酊質(zhì)量標(biāo)準的研究較少［2］，原質(zhì)控標(biāo)準僅對該制劑中龍腦進行測定，難以有效反應(yīng)制劑質(zhì)量［3］。經(jīng)GC-MS 鑒定，重樓解毒酊中含有1，8-桉葉素、樟腦、龍腦、β-細辛醚和α-細辛醚等成分。1，8-桉葉素、樟腦、龍腦具有抗菌、殺蟲、疏風(fēng)散熱、祛濕解毒的作用，同時對多種藥物具有良好的透皮滲透作用［4-10］;β-細辛醚和α-細辛醚具有抗炎、殺菌等作用［11-15］，均與本方主治功能相符，故這5 個成分均為該制劑有效成分。為了更好地體現(xiàn)中藥制劑的多靶點、多效應(yīng)的作用機理并完善其質(zhì)量標(biāo)準，本實驗利用GC-FID 建立了同時測定1，8-桉葉素、樟腦、龍腦、β-細辛醚、α-細辛醚的方法，該方法準確可靠，為更好地控制重樓解毒酊質(zhì)量提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 HP-6890 氣相色譜儀，氫火焰離子檢測器(美國Agilent 公司);AL-204 電子天平(梅特勒-托利多);艾本德手動單道移液槍(量程為20 ～200 μL 和100 ～1 000 μL 各一個)。

1.2 試藥 1，8-桉葉素(批號110788-200705)、樟腦(批號110747-200507)、龍腦(批號110881-201107)、α-細辛醚(批號100298-201002)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院，β-細辛醚對照品(自制，純度≥99.0 %);萘(分析純，天津市致遠化學(xué)試劑有限公司);無水乙醇(色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司);樣品重樓解毒酊為市售 (45 mL/瓶，貴州圣濟堂制藥有限公司生產(chǎn))。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 HP-INNOWAX 毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm ×0.25 μm);升溫程序為初始溫度60 ℃保持5 min，以5 ℃/min 升至120 ℃保持5 min，再以5 ℃/min 升至180 ℃保持10 min，最后以20 ℃/min 升至240 ℃，保持3 min;進樣口溫度250 ℃，分流進樣，分流比為5 ∶1，體積流量1.5 mL/min，進樣量1 μL，載氣為氮氣;FID檢測器溫度250 ℃。

2.2 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取萘122.8 mg，置于50 mL量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得2.456 mg/mL 的萘內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3 對照品溶液制備 精密稱取1，8-桉葉素、樟腦、龍腦、β-細辛醚、α-細辛醚適量，用無水乙醇溶解制成質(zhì)量濃度分別為0.073 8、0.240、3.64、0.690、0.126 mg/mL 的對照品貯備液。精密吸取1，8-桉葉素貯備液300 μL 于5 mL 量瓶中，再分別加入樟腦對照貯備液200 μL、龍腦對照貯備液1 000 μL，β-細辛醚對照貯備液800 μL、α-細辛醚對照貯備液200 μL，最后加入200 μL 的內(nèi)標(biāo)溶液，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為0.004 43、0.009 60、0.728、0.110、0.005 02 mg/mL的混合對照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備 精密吸取重樓解毒酊0.50 mL 于5 mL 量瓶內(nèi)，加0.20 mL 內(nèi)標(biāo)溶液，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻。取該溶液1 mL 于離心管中離心，取上清液進樣。

2.5 陰性樣品溶液 按重樓解毒酊的組成處方及生產(chǎn)工藝分別制成缺石菖蒲陰性樣品以及缺石菖蒲、艾葉和艾片的陰性樣品。

2.6 系統(tǒng)適用性試驗 分別吸取樣品溶液、混合對照品溶液、陰性樣品溶液1 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜峰，見圖1。結(jié)果表明:陰性樣品溶液在1，8-桉葉素、樟腦、龍腦、β-細辛醚和α-細辛醚色譜主峰位置均無色譜峰出現(xiàn)，陰性樣品對5 個有效成分的測定均無干擾。

2.7 線性關(guān)系考察 依次精密吸取“2.3”項下1，8-桉葉素貯備液100、150、300、450、600 μL于5 個5 mL 量瓶中，再依次加入樟腦貯備液50、100、200、300、400 μL，龍腦貯備液250、500、1 000、1 500、1 700 μL，β-細辛醚貯備液200、400、800、1 200、1 400 μL，α-細辛醚貯備液50、100、200、300、400 μL，最后分別加入200 μL 萘標(biāo)溶液，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取1 μL 進氣相色譜儀，按上述色譜條件進行測定，回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍見表1，結(jié)果表明各組分在各自進樣范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.8 精密度試驗 精密吸取同一混合對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下連續(xù)進樣分析6 次，以1，8-桉葉素、樟腦、龍腦、β-細辛醚和α-細辛腦對萘標(biāo)峰面積的比值計算RSD (n = 6)值分別為1.2%、0.9%、0.5%、0.8%、0.5%。結(jié)果表明，儀器的精密度良好。

圖1 對照品(A)、樣品(B)、缺石菖蒲陰性樣品(C)、缺石菖蒲、艾葉和艾片陰性樣品(D)的色譜圖Fig.1 GC chromatograms of mixed reference substances(A )，sample (B)，sample without Acori tatarinowii Rhizoma (C)and sample without Acori tatarinowii Rhizoma，Artemisiae argyi Folium and lborneolum (D)

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果Tab.1 Calibration curve and linear range

2.9 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，室溫放置，于0、2、4、8、12、24 h 時間點分別進樣分析。記錄峰面積，結(jié)果按照1，8-桉葉素、樟腦、龍腦、β-細辛醚和α-細辛腦與萘標(biāo)峰面積之比計算 RSD 值分別為1.4%、1.6%、2.2%、2.5%、3.5%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 重復(fù)性試驗 取同一批號(20121103)的重樓解毒酊，按照“2.4”項下方法平行制備6 份供試品溶液。在“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜峰面積。用內(nèi)標(biāo)法計算，1，8-桉葉素、樟腦、龍腦、β-細辛醚和α-細辛腦的RSD (n =6)分別為1.6%、1.6%、1.1%、1.5%、1.0%。結(jié)果表明該方法的重復(fù)性較好。

2.11 加樣回收率試驗 精密吸取已知含有量的重樓解毒酊(批號20121103)共9 份，置5 mL 量瓶中，每份0.25 mL。分別用移液槍準確加入“2.3”項下1，8-桉葉素貯備液0.171、0.214、0.257 mL各3 份、樟腦貯備液0.097、0.121、0.145 mL 各3份、龍腦貯備液0.119、0.149、0.179 mL 各3 份、β-細辛醚0.283、0.354、0.425 mL 各3 份、α-細辛醚0.091、0.113、0.136 mL 各3 份，每一份都加入0.20 mL 萘標(biāo)，用無水乙醇稀釋至刻度，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，計算平均回收率，結(jié)果見表2。

2.12 樣品測定 取3 批樣品，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，每批次平行制備3 份，在“2.1”項色譜條件下測定1，8-桉葉素、樟腦、龍腦、β-細辛醚和α-細辛醚的量，結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 有效成分鑒定 本實驗利用GC-MS 法對重樓解毒酊中可氣化有效成分進行鑒定，結(jié)果表明，其可氣化物質(zhì)較為復(fù)雜，經(jīng)NIST08 譜庫鑒定并結(jié)合文獻確定了1，8-桉葉素、樟腦、龍腦、β-細辛醚、α-細辛醚為該制劑的主要有效成分。

3.2 前處理方法考察 重樓解毒酊中乙醇體積分數(shù)在45% ～55% 之間，樣品中含有一定量的多糖，本實驗前處理采用無水乙醇處理樣品，使樣品乙醇體積分數(shù)提高至90% 以上，可以將多糖沉淀出來，降低了對進樣口的污染，提高了結(jié)果的精密度。本實驗采用HP-INNOWAX 柱作為分析柱，該柱不僅分離效果和峰型均優(yōu)于其他色譜柱，而且該柱可以允許進水，故供試品溶液無需用無水硫酸鈉干燥處理，該前處理方法較為簡單，回收率較高。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果Tab.2 Result of recovery tests

3.3 色譜條件考察 對柱溫進行了多種選擇，采用恒溫及不同的程序升溫方法。經(jīng)比較，選擇文中所述四階程序升溫方法效果最佳，既能滿足5 個成分同時分析，又能有效分離各待測物質(zhì)及內(nèi)標(biāo)物，且分析時間比較合理。

表3 樣品測定結(jié)果(mg·mL -1)Tab.3 Results of sample determination (mg·mL -1)

該方法方便快捷，準確度高，能夠有效控制重樓解毒酊的質(zhì)量。

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