載10-羥基喜樹堿超聲微泡的制備、表征及其體外超聲成像特性

李思陽， 孔慶新， 王 洋

(1. 江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇淮安223003;2. 東北林業(yè)大學(xué)鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心，東北油田鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱150040)

喜樹堿 (camptothecin，CPT)是1966 年由Wall 等［1］從我國特有珙桐科植物喜樹Camptotheca acuminata Decne 中分離得到的一種吲哚類生物堿［2］，具有良好的抗腫瘤活性［3］。10-羥基喜樹堿(10-hydroxycamptothecin，HCPT)是喜樹堿的純天然微量衍生物［2］，是我國臨床使用的重要抗腫瘤類藥物［4］，但由于不良反應(yīng)大、生物利用度低限制了其應(yīng)用［2］。因此，改進劑型、修飾結(jié)構(gòu)、以及研究新型藥物傳遞系統(tǒng)成為關(guān)注的熱點［5-6］。

超聲微泡也稱超聲造影劑，是一種含氣體的高分子微泡［7］，超聲微泡作為載藥工具有以下特點:(1)靶向作用［7］;(2)藥物在靶組織中可以維持較高的濃度［7-9］; (3)顯著提高基因轉(zhuǎn)染率［10］;(4)降低機體免疫反應(yīng)［7-11］。聚乳酸也稱為聚丙交酯(polylactide)，是一種常見的可生物降解的高分子多聚物成膜材料，具有無毒、化學(xué)穩(wěn)定好、成球性好、生物相容性良好等特性［12］。PLA 載藥微泡具有適用藥物范圍廣，載藥量高，表面易修飾，輔助識別功能等優(yōu)點［13］。

本研究以聚乳酸為材料，以W/O/W 型乳化溶劑揮發(fā)法制備載羥基喜樹堿超聲微泡，以保證其在體內(nèi)釋放的穩(wěn)定性，使其達到一種長期平穩(wěn)緩釋的效果，為進一步的藥代動力學(xué)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 試藥 聚乳酸(PLA)(山東省醫(yī)療器械研究所);HCPT (批號081020，純度99%，哈爾濱峰源高科技開發(fā)有限公司);其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備 Cary Eclipse 熒光光譜儀(美國Varian 公司);FEI QUANTA 200 掃描電子顯微鏡(美國FEI 公司);FD5505 真空離心濃縮系統(tǒng)(美國SIM 公司);KQ-50 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);LA-920 型激光散射粒度儀(日本HORIBA 公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 載羥基喜樹堿超聲微泡的制備 稱取10 mg HCPT、250 mg PLA 于10 mL 二氯甲烷中，磁力攪拌30 min 至溶液完全混勻。取出轉(zhuǎn)子，加入0.5 mL 4%的(NH4)2CO3溶液，探頭超聲(110 W，30 s)，形成初級W/O 微球。然后將得到的初級微乳緩慢滴加到預(yù)冷的25 mL 2% PVA 溶液中，使用高速分散均質(zhì)機勻化(9 000 r/min，5 min)，形成W/O/W微球。將上述溶液轉(zhuǎn)移至50 mL 1%的異丙醇溶液中，磁力攪拌4 h，使微球表面逐漸固化，并完全去除二氯甲烷。將得到的乳液5 000 ×g 離心5 min，去上清液。沉淀加入30 mL正己烷洗滌，重復(fù)3 次，所得沉淀空氣干燥，除去殘留的正己烷。加3 mL 去離子水于沉淀中，渦旋，使沉淀充分分散后用液氮預(yù)凍，于-53 ℃下真空冷凍干燥48 h，將樣品稱定質(zhì)量后密封低溫避光保存。

2.2 掃描電子顯微鏡觀察 稱取3 mg 凍干粉樣品于離心管中，加入適量去離子水，渦旋，使凍干粉分散均勻，取50 μL 懸濁液于鋁片上，涂抹均勻，噴金后觀察樣品。掃描電鏡圖像在12.5 kV、9.5 mm工作距離的陽離子加速電壓下獲得。其結(jié)果見圖1。

圖1 載羥基喜樹堿超聲微泡掃描電鏡圖像Fig.1 SEM image of HCPT-loaded microbubbles

由圖1 可以看出，載羥基喜樹堿超聲微泡呈明顯的球狀結(jié)構(gòu)，表面光滑，粒徑大小在2 μm 左右。有一定的聚集現(xiàn)象，主要是因為在樣品制備的過程中，干燥、噴金等步驟會其有一定的影響，但依然保持著完好的球形結(jié)構(gòu)，證明了其穩(wěn)定性。此外，在真空冷凍干燥的過程中，由于碳酸銨的揮發(fā)，會形成一些表面帶孔狀的微球，這一結(jié)構(gòu)有利于微泡在超聲破碎的過程中將HCPT 釋放出來。

2.3 粒徑分布 粒度的大小及分布是評價超聲微泡性能的重要指標(biāo)，通過靜態(tài)光散射的方法測定空白超聲微泡和載羥基喜樹堿超聲微泡的粒度及分布。結(jié)果見圖2。

圖2 結(jié)果表明，新型微泡具有多分散性，和空白超聲微泡相比，載羥基喜樹堿超聲微泡的粒徑大小和分布沒有明顯變化，粒度分布比較集中，所有的微泡粒徑都小于6 μm，可以達到臨床使用的安全范圍。粒徑大小在0.45 ～5.12 μm 之間分布，這與掃描電子顯微鏡觀察的結(jié)果相吻合。

2.4 包封率和載藥量測定

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱取HCPT 對照品5.0 mg，于50 mL 量瓶中，用DMSO 定容得0.1 mg/mL 的母液。將母液分別稀釋至0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 μg/mL 系列對照品溶液。通過熒光分光光度計［7］檢測HCPT 的激發(fā)波長Ex和發(fā)射波長Em，確定其激發(fā)波長Ex=373 nm，發(fā)射波長Em=430 nm，在此條件下測定對照品溶液的吸光度值。以HCPT 的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y =1 208.1x +16.022，r2=0.998 5，結(jié)果表明HCPT 在0.1 ～0.8 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 空白微泡(A)和載羥基喜樹堿超聲微泡(B)粒度分布Fig.2 Size distribution of freshly prepared blank microbubbles (A)and HCPT-loaded microbubbles (B)

2.4.2 包封率和載藥量測定 精密稱取5 mg 凍干粉樣品3 份，分別加入4 mL DMSO 使其完全溶解，稀釋300 倍，測定其吸光度值，根據(jù)“2.4.1”項標(biāo)準(zhǔn)曲線計算HCPT 量，并根據(jù)公式(1)和(2)計算包封率和載藥量。

載羥基喜樹堿超聲微泡的包封率和載藥量分別為(67.44 ±2.55)%、 (4.10 ±1.29)%。結(jié)果表明，這種載羥基喜樹堿超聲微泡具有很高的載藥量，能夠?qū)崿F(xiàn)藥物的有效運載，可以作為載藥系統(tǒng)傳遞HCPT。

2.5 體外釋藥特性研究

2.5.1 HCPT-PBS 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱取5 mg HCPT 粉末，用DMSO 定容至50 mL，得到0.1 mg/mL HCPT 母液。母液用PBS 溶液分別稀釋至0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 μg/mL 系列對照品溶液。通過熒光分光光度計檢測HCPT 在PBS 中的激發(fā)波長Ex=375 nm，發(fā)射波長Em=552 nm，在此條件下進行熒光分光光度分析，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以HCPT 質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y = 206.54 x + 7.136 7，R2=0.999 1，表明HCPT 在0.1 ～1 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.2 體外釋放 精密稱取2 mg 凍干粉末樣品于10 mL 離心管中，加入5 mL 去離子水，待渦旋混勻后，吸取1 mL 溶液于透析袋內(nèi)密封。透析袋置于25 mL PBS (pH=7.4)釋放介質(zhì)中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中磁力攪拌，在0.08、0.16、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、8、10、12、18、24、36、48 h 時間點分別取3 mL 釋放液并補充相同體積的新鮮釋放液。使用熒光分光光度計測定釋放液中HCPT 的吸光度值，通過“2.5.1”項標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出釋放液中HCPT 的量，計算出累積釋放率。結(jié)果見圖3。

圖3 載羥基喜樹堿超聲微泡體外釋放Fig.3 In vitro release of free HCPT and HCPTloaded microbubbles

從圖3 中可以看出，游離HCPT 釋放較快，約4 h 累積釋放率超過了80%，12 h 后基本釋放完全;載羥基喜樹堿微泡持續(xù)緩慢釋放，48 h 后，累積釋放率接近60%，且仍然繼續(xù)釋放。這一結(jié)果充分證實了載羥基喜樹堿超聲微泡具有連續(xù)的釋放特性和明顯的緩釋效果，為下一步的體內(nèi)釋放試驗提供一定的數(shù)據(jù)支持。

2.6 體外超聲成像［14］通過體外超聲顯影效果來評價載羥基喜樹堿超聲微泡的超聲成像特性。以醫(yī)用級硅膠管作為血管模型，在管中分別注入載羥基喜樹堿超聲微泡和經(jīng)脫氣處理的蒸餾水，在普通B超模式和脈沖反向諧波模式(PIHI)條件下同時成像，用超聲診斷儀檢測和比較兩者的超聲效果。結(jié)果見圖4。

圖4 載羥基喜樹堿超聲微泡體外超聲成像圖Fig.4 In vitro ultrasound images of HCPTloaded microbubbles

從圖像中可以看出，由于管壁密度較大，當(dāng)推注脫氣水后，在超聲場里回聲較高，但是管腔呈現(xiàn)無回聲狀態(tài)(圖4a 和4b)。當(dāng)推注載羥基喜樹堿超聲微泡之后(圖4c 和4d)，與推注之前相比，硅膠管管腔回聲明顯增強，呈現(xiàn)密集細點狀強回聲，說明了制備的載羥基喜樹堿超聲微泡具有較好的體外超聲特性，可以進行臨床的深入開發(fā)與應(yīng)用。

3 討論

羥基喜樹堿是一種臨床應(yīng)用非常廣泛的抗癌藥物［15］，已經(jīng)廣泛引起各國研究者的關(guān)注。但是由于其活性內(nèi)酯環(huán)容易開環(huán)，往往導(dǎo)致其藥理活性降低。針對該缺陷，眾多學(xué)者紛紛通過修飾其活性內(nèi)酯環(huán)的結(jié)構(gòu)或改變羥基喜樹堿的劑型，通過新型載藥系統(tǒng)來傳遞藥物，如脂質(zhì)體［16］、納米顆粒等形式［17］，這些給藥系統(tǒng)能夠在一定程度上提高藥物的療效，降低其毒副作用。

本課題組研究采用的PLA 具有良好的生物降解性，是獲得美國FDA 批準(zhǔn)的可用于注射的藥用輔料之一。以W/O/W 型乳化溶劑揮發(fā)法制備載羥基喜樹堿超聲微泡，該超聲微泡粒度分布在0.45 ～5.12 μm 之間，載藥量和包封率分別為(4.10 ±1.29)%和(67.44 ± 2.55)%，體外釋放可持續(xù)48 h，累積釋放率達到60%，具有良好的緩釋效果。體外超聲成像顯示該微泡具有良好的反射超聲信號能力，可以作為載藥超聲造影劑進行深入的研究和應(yīng)用。此外，該研究對于載羥基喜樹堿超聲微泡的藥代動力學(xué)研究提供一定的數(shù)據(jù)支持。

［1］ Wall M E，Wani M C，Cook C E，et al. Plant antitumor agents. I. The isolation and structure of camptothecin，a novel alkaloidal leukemia and tumor inhibitor from Camptotheca acuminata［J］. J Am Chem Soc，1966，88(16):3888-3890.

［2］ 李思陽，鄭 健，駱沙曼，等. 10-羥基喜樹堿的聚賴氨酸/海藻酸鈉微膠囊的制備及其體外釋藥特性研究［J］. 中草藥，2011，42(9):1724-1727.

［3］ 楊玉煥，邵長敏，駱沙曼，等. 10-羥基喜樹堿緩釋微膠囊的組織分布學(xué)研究［J］. 中成藥，2013，35(8):1644-1648.

［4］ 郭宏紅. 羥基喜樹堿微膠囊藥代動力學(xué)研究［D］. 哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué)，2011.

［5］ 宋文霞，索緒斌，鄧妍芳，等. 羥基喜樹堿/羥丙基-β-環(huán)糊精包合物凝膠骨架緩釋片的制備及體外釋放［J］. 中成藥，2013，35(6):1188-1192.

［6］ 華海嬰，馮 欣，趙永星，等. 羥基喜樹堿納米晶體抗腫瘤作用及其機制評價［J］. 中成藥，2010，32 (12):2048-2052.

［ 7］ 李思陽. 羥基喜樹堿緩釋制劑的制備及其表征［D］. 哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué)，2012.

［8］ Fokong S，Theek B，Wu Z，et al. Image-guided，targeted and triggered drug delivery to tumors using polymer-based microbubbles［J］. J Control Rel，2012，163(1):75-81.

［ 9］ 費小非，曹心珂，湯致強. 超聲微泡造影劑在腫瘤治療方面的研究進展［J］. 中國新藥雜志，2006，15 (13):1057-1060.

［10］ 何年安. 超聲靶向微泡破壞促進基因轉(zhuǎn)染與藥物傳送的實驗研究［D］. 上海:復(fù)旦大學(xué)，2011.

［11］ 楊 健. 載多烯紫杉醇靶向脂質(zhì)微泡聯(lián)合超聲靶向微泡破裂技術(shù)對肝癌作用及其機制的實驗研究［D］. 重慶:重慶醫(yī)科大學(xué)，2012.

［12］ Lucas N，Bienaime C，Belloy C，et al. Polymer biodegradation:mechanism and estimation［J］. Chemosphere，2008，73(4):429-442.

［13］ Nampoothiri K M，Nair N R，John R P. An overview of the recent developments in polylactide (PLA)research［J］. Biores Technol，2010，101(22):8493-8501.

［14］ 郭盛磊. 喜樹堿衍生物CZ48 高分子載體系統(tǒng)的構(gòu)建及其性能研究［D］. 哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué)，2012.

［15］ 索緒斌，李慕玲，王玉強，等. 羥基喜樹堿的油/水分配系數(shù)與大鼠小腸吸收的相關(guān)研究［J］. 中成藥，2010，32(4):566-569.

［16］ 凌家俊，古錦輝，謝 毅，等. 羥基喜樹堿磁性脂質(zhì)體的制備及其靶向性特征試驗［J］. 中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，18(16):19-23.

［17］ 王 瑩，祖元剛，趙修華. 羥基喜樹堿納米顆粒超聲反溶劑法制備工藝及表征［J］. 植物研究，2012，32(3):369-372.