艾葉水提物及其發(fā)酵物體內(nèi)外抗陰道毛滴蟲作用

白 靜， 胡 雷， 張 麗， 田春雨， 龐得全， 薄海美， 韓淑英*

(1. 河北聯(lián)合大學(xué)，河北 唐山063000;2. 唐山市工人醫(yī)院，河北 唐山063000)

滴蟲性陰道炎是婦科常見病。目前臨床上常采用甲硝唑治療，但該藥可導(dǎo)致消化、神經(jīng)、血液、皮膚等系統(tǒng)的不良反應(yīng)，且有潛在的致癌、致畸、致突變作用［1-2］。此外陰道毛滴蟲對甲硝唑的耐藥性為9.6%［3］。因此尋找更為安全有效的治療藥物是十分必要的。艾葉是我國傳統(tǒng)中藥，為菊科植物艾蒿Artemisi argyi Levl. et Vant. 的干燥葉。具有溫經(jīng)止血、散寒止痛、調(diào)經(jīng)安胎、除濕止癢、通經(jīng)活絡(luò)等功效［4-5］，現(xiàn)代藥理研究表明其具有鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒、鎮(zhèn)咳、平喘、祛痰等藥理作用［6-7］。民間常單獨或組成復(fù)方制劑用于細菌性或霉菌性陰道炎的治療［8］，對于是否能用于滴蟲性陰道炎的治療未見報道，本實驗利用中藥發(fā)酵技術(shù)，將艾葉水提物進行生物發(fā)酵，將所得艾葉發(fā)酵物與水提物進行療效比較，以期獲得更為有效的治療陰道毛滴蟲的藥物。

1 材料

1.1 動物 SPF 級昆明小鼠，體質(zhì)量18 ～22 g，雌性，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK ＜京＞2009-0008。

1.2 受試藥物 艾葉水提物:將艾葉研碎，水浴加熱煮沸2 h 后，4 層紗布過濾，將濾渣繼續(xù)浸煮2 h，將兩次濾液合并，濃縮成每100 mL 含生藥100 g。艾葉發(fā)酵物:取高壓滅菌后的增殖菌液體培養(yǎng)基(蛋白胨40 g，酵母浸粉20 g，葡萄糖40 g于1 000 mL 蒸餾水中)于無菌容器內(nèi)，無菌環(huán)境下加安琪干酵母10 g/100 mL，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h。將活化增殖的酵母菌液加入等體積的上述艾葉水提物、6%蛋白胨、6%葡萄糖，混合均勻后繼續(xù)發(fā)酵。發(fā)酵條件為:培養(yǎng)溫度37 ℃，培養(yǎng)時間72 h。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵物加入無水乙醇，使乙醇終體積分?jǐn)?shù)達到70%，在70 ℃萃取4 h，將提取液離心15 min，2 500 r/min。取上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上回收乙醇，回收乙醇后的剩余液即為醇提后的艾葉發(fā)酵物，每1 00 mL 艾葉發(fā)酵物含生藥50 g。將上述艾葉水提物也稀釋成50 g 生藥/100 mL。陽性對照藥物甲硝唑氯己定洗劑:每1 mL 含葡萄糖酸氯己定1.2 mg、甲硝唑0.2 mg，深圳佳泰藥業(yè)有限公司，批號A110822L。

1.3 試劑 兔肝(河北聯(lián)合大學(xué)實驗動物中心提供);蛋白胨(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號20120206);半胱氨酸鹽酸鹽(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號20111012);麥芽糖(汕頭市光華化學(xué)廠，批號20100815);胎牛血清(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，批號20100628011);注射用青霉素鈉(華北制藥股份有限公司，批號X1112407);注射用硫酸鏈霉素(華北制藥股份有限公司，批號1110109);苯甲酸雌二醇 (天津必佳藥業(yè)集團有限公司，批號20120101)。

1.4 陰道毛滴蟲蟲株來源 陰道毛滴蟲取自河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院婦科門診并經(jīng)醫(yī)生確診為滴蟲性陰道炎患者的陰道分泌物，轉(zhuǎn)種3 代后備用。

1.5 儀器 mLS-3750 高壓滅菌器，日本SANYO公司;HR40-IIA2 生物安全柜，青島海爾公司;Coic 倒置顯微鏡XDS-1B，重慶光電儀器有限公司;CO2恒溫培養(yǎng)箱2123TC，美國SHEL-LAB 公司。

2 方法

2.1 體外試驗 取滅菌小試管進行編號，設(shè)置艾葉水提物、艾葉發(fā)酵物、甲硝唑、空白對照4 個試驗組，藥物組分別設(shè)置6 個劑量，分別為1 ∶5，1 ∶10，1 ∶20，1 ∶40，1 ∶80，1 ∶160。1 ∶5 劑量配制方法為2.4 mL 肝浸湯培養(yǎng)液+0.6 mL 受試藥物，從此管中取出1.5 mL 至下一管中，按2 倍稀釋法依次類推進行稀釋，空白組管中加入1.5 mL肝浸湯培養(yǎng)液。每管重復(fù)5 次。將轉(zhuǎn)種第3 代滴蟲用血球計數(shù)板計數(shù)，用培養(yǎng)液將其密度調(diào)至1 ×105個/mL?；钕x比例99%以上，取0.5 mL 滴蟲混懸液加入各試驗管內(nèi)，置37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)4、8、16、24 h 后，于倒置顯微鏡下觀察，記錄活蟲數(shù)。其方法為用吸管吸取一滴陰道毛滴蟲懸液(吸前用干凈吸管吹打均勻)，滴入計數(shù)板凹槽內(nèi)，至蓋玻片下被液體充滿為止，2 min 后，在顯微鏡下計數(shù)活蟲體數(shù)(只計數(shù)對角線)對于壓線的蟲體只計數(shù)在上線和左線者，對于蟲體團按單個蟲體計數(shù)，蟲體變圓、膨脹或收縮，鞭毛和波動膜不活動或輪廓不清、邊緣不整、蟲體裂解、溶解或蟲體內(nèi)完全顆粒變性者判定為死亡。計算各管活蟲密度。按以下公式計算相對抑制率。相對抑制率=［(空白對照組滴蟲密度-加藥組滴蟲密度)/空白對照組滴蟲密度］× 100%，活蟲數(shù)等于或高于接種數(shù)視為藥物無效。

2.2 體內(nèi)試驗 昆明小鼠110 只，每只小鼠背部皮下注射苯甲酸雌二醇0.25 mL，隔天注射一次，連續(xù)3 次。于注射次日，除空白對照組外，其余各組用20 μL 微量加樣器吸取密度為1 ×107個/mL蟲體混懸液20 μL 注入小鼠陰道深部。于接種第5天進行陰道分泌物鏡檢，若鏡檢有大量活動陰道毛滴蟲，即確定造模成功。將成模小鼠隨機分為模型對照組、甲硝唑組(0.2 mg/mL)、艾葉水提物組(20 mg 生藥/mL)，艾葉發(fā)酵物低、中、高劑量組(10、20、40 mg/mL)，每組15 只。次日除空白及模型組外，其余各組用微量加樣器給予相應(yīng)藥物50 μL，連續(xù)陰道給藥7 d。于給藥第3 天及末次給藥次日(給藥第8 天)用50 μL 無菌生理鹽水反復(fù)沖洗陰道，滴入血球計數(shù)板凹槽內(nèi)，記錄活蟲體數(shù)。

2.3 陰道組織病理學(xué)檢查 于給藥第8 天陰道灌洗后，脫臼處死小鼠，解剖分離出每組小鼠陰道組織，常規(guī)石蠟包埋，HE 染色，鏡下觀察病理變化。切片標(biāo)本鏡下按充血、水腫、出血、浸潤四項基本指標(biāo)進行評分，無充血、水腫、出血、浸潤評0 分，輕度評1 分，中度評2 分，重度評3 分，分別用“-”、“+”、“+ +”、“+ + +”來表示。評分標(biāo)準(zhǔn)見文獻［9］。

2.4 統(tǒng)計方法 采用SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計分析，分析方法為重復(fù)測量設(shè)計方差分析及bonferroni 法。

3 結(jié)果與分析

3.1 體外試驗 結(jié)果見表1。與艾葉水提物相比，同劑量下艾葉發(fā)酵物在4 ～24 h 體外對陰道毛滴蟲抑制率均有顯著差異(P ＜0.01)，艾葉發(fā)酵物在1 ∶5及1 ∶10 劑量下24 h 對滴蟲的抑制率達到100%，可殺死全部蟲體，且在1 ∶10 劑量下其作用優(yōu)于甲硝唑(P ＜0.05);艾葉發(fā)酵物同一劑量隨著時間延長，其對蟲體抑制率也有升高趨勢。

表1 不同劑量受試藥物不同時間體外對陰道毛滴蟲抑制率(±s，n=5)Tab.1 Inhibition ratio of tested drugs with various concentrations on trichomonas vaginalis at different times in vitro (±s，n=5)

表1 不同劑量受試藥物不同時間體外對陰道毛滴蟲抑制率(±s，n=5)Tab.1 Inhibition ratio of tested drugs with various concentrations on trichomonas vaginalis at different times in vitro (±s，n=5)

注:同劑量下與艾葉水提物比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;同劑量下與艾葉發(fā)酵物比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01

藥物 稀釋劑量 藥物不同時間陰道毛滴蟲抑制百分率/%4 h 8 h 16 h 24 h艾葉水 1 ∶5 46.22 ±10.37 46.41 ±7.87 48.81 ±10.82 47.25 ±3.67提物 1 ∶10 35.62 ±11.40 36.86 ±2.25 36.69 ±10.08 38.87 ±4.45 1 ∶20 13.85 ±6.66 15.65 ±5.77 13.25 ±2.86 10.17 ±7.04 1 ∶40 8.29 ±7.26 10.04 ±1.28 12.93 ±7.80 13.00 ±0.00 1 ∶80 2.22 ±0.37 4.41 ±0.87 5.81 ±0.82 7.25 ±0.67 1 ∶160 1.25 ±0.12 1.34 ±0.15 1.28 ±0.65 2.15 ±0.26艾葉發(fā) 1 ∶5 96.35 ±4.23 ＊＊ 99.21 ±7.34 ＊＊ 100.0 ±0.00 ＊＊ 100.0 ±0.00 ＊＊酵物 1 ∶10 96.26 ±4.14 ＊＊ 97.34 ±3.49 ＊＊ 99.33 ±3.26 ＊＊ 100.0 ±0.00 ＊＊1 ∶20 76.22 ±10.37 ＊＊ 89.41 ±7.87 ＊＊ 89.81 ±10.82 ＊＊ 90.25 ±3.67 ＊＊1 ∶40 55.62 ±11.40 ＊＊ 56.86 ±2.25 ＊＊ 56.69 ±10.08 ＊＊ 58.87 ±4.45＊＊1 ∶80 32.85 ±6.66 ＊＊ 35.65 ±5.77 ＊＊ 36.25 ±2.86 ＊＊ 38.17 ±7.04 ＊＊1 ∶160 20.29 ±7.26 ＊＊ 24.04 ±1.28 ＊＊ 26.93 ±7.80 ＊＊ 20.00 ±0.00 ＊＊甲硝唑 1 ∶5 97.16 ±2.46 100.0 ±0.00 100.0 ±0.00 100.0 ±0.00 1 ∶10 78.12 ±1.13 # 87.70 ±9.41 # 87.99 ±2.83 # 87.20 ±1.34 #1 ∶20 62.81 ±5.70 # 81.43 ±10.62 89.05 ±3.85 93.12 ±0.99 #1 ∶40 54.51 ±6.86 75.11 ±11.90 78.71 ±4.92 80.05 ±0.95 1 ∶80 35.42 ±6.59 40.33 ±16.03 41.05 ±2.75 41.99 ±3.73 1 ∶160 20.33 ±5.72 21.43 ±12.86 28.88 ±6.15 22.48 ±2.40

3.2 體內(nèi)試驗 與空白對照組比較，模型對照組小鼠陰道內(nèi)鏡檢可見大量陰道毛滴蟲。與模型對照組比較，艾葉水提物組和艾葉發(fā)酵物不同劑量組在給藥第3 天和第8 天可明顯減少陰道毛滴蟲數(shù)量(P ＜0.05，P ＜0.01)，艾葉發(fā)酵物組作用更明顯(P ＜0.01)，且隨劑量增大，作用增強。見表2。

3.3 HE 染色陰道組織病理檢查 表3、圖1 結(jié)果顯示，模型對照組小鼠陰道組織出現(xiàn)重度充血、水腫，有大量炎細胞浸潤;與模型對照組比較，艾葉水提物組陰道組織病變程度亦較重，艾葉發(fā)酵物高劑量組小鼠輕度充血、水腫，少量炎細胞浸潤，其治療效果與甲硝唑相近。

表2 各組小鼠體內(nèi)陰道毛滴蟲密度(±s，n=15)Tab.2 Concentrations of trichomonas vaginalis in mice in each group (±s，n=15)

表2 各組小鼠體內(nèi)陰道毛滴蟲密度(±s，n=15)Tab.2 Concentrations of trichomonas vaginalis in mice in each group (±s，n=15)

注:與空白對照組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型對照組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01;與艾葉水提物組比較，Δ P ＜0.05，ΔΔP ＜0.01。下表同

組別 劑量/(mg 生藥·mL -1) 給藥第3 天蟲體密度/(×102·mL -1) 給藥第8 天蟲體密度(×102·mL -1)空白對照組-0 0模型對照組 - 232.38 ±23.05＊＊ 341.69 ±36.59＊＊艾葉水提物組 20 165.26 ±13.56# 186.25 ±12.03#艾葉發(fā)酵物組 10 12.45 ±0.13##ΔΔ 9.06 ±0.10##ΔΔ艾葉發(fā)酵物組 20 0.95 ±0.25##ΔΔ 0.15 ±0.01##ΔΔ艾葉發(fā)酵物組 40 0.28 ±0.09##ΔΔ 0.03 ±0.00##ΔΔ甲硝唑組 0.2 0.17 ±0.01##ΔΔ 0.01 ±0.00##ΔΔ

表3 各組小鼠陰道病理組織評分動物數(shù)(±s，n=15)Tab.3 Number distribution of vaginal tissue damage scores in each group (±s，n=15)

表3 各組小鼠陰道病理組織評分動物數(shù)(±s，n=15)Tab.3 Number distribution of vaginal tissue damage scores in each group (±s，n=15)

組別 劑量/(mg 生藥·mL -1) 0 分 1 分 2 分 3分15 0 0 0模型對照組＊＊ - 0 0 4 11艾葉水提物# 20 0 5 6 4艾葉發(fā)酵物低劑量組##ΔΔ 10 5 3 5 2艾葉發(fā)酵物中劑量組##ΔΔ 20 10 3 1 1艾葉發(fā)酵物高劑量組##ΔΔ 40 13 1 1 0甲硝唑組##ΔΔ空白對照組-0.2 12 2 1 0

圖1 HE 染色各組小鼠陰道組織圖Fig.1 HE staining figures of vaginal tissue of mice

4 討論

艾葉為我國傳統(tǒng)中藥，目前常制作成艾灸用于臨床［10］，傳統(tǒng)工藝制備的艾葉水提物其藥理作用較弱，臨床并未得到廣泛應(yīng)用。為將艾葉開發(fā)成更有價值的新型藥物，本研究采用中藥發(fā)酵技術(shù)進行中藥炮制，該方法是以中藥為反應(yīng)底物，通過微生物發(fā)酵過程對其結(jié)構(gòu)進行修飾、轉(zhuǎn)化從而達到提高中藥藥效、降低毒性、促進吸收、改善口味等目的［11-12］。目前該技術(shù)已成為一種新型的中藥研究技術(shù)，并取得了一定的成績。如用酵母菌發(fā)酵大黃，會使大黃總蒽醌、結(jié)合性蒽醌量稍有降低，分離型蒽醌的量會增加，從而起到減毒增效的作用［13］。王玉紅等［14］將黃芪加入到靈芝發(fā)酵的過程中，使得多糖的成分發(fā)生變化，增加了產(chǎn)生新的物質(zhì)的可能性。

本研究以中藥艾葉為反應(yīng)底物，通過酵母菌發(fā)酵過程對艾葉中成分進行修飾，以期得到更為有效的抗白色念珠菌治療藥物。結(jié)果表明在體外試驗中，與艾葉水提物組相比，在相同劑量同一時間下艾葉發(fā)酵物組在體外對陰道毛滴蟲的抑制作用相對較強(P ＜0.01)，艾葉發(fā)酵物在1 ∶5 及1 ∶10 劑量下24 h對滴蟲的抑制率達到100%，且在1 ∶10劑量下作用優(yōu)于甲硝唑(P ＜0.05)。在體內(nèi)試驗中與艾葉水提物比，艾葉發(fā)酵物不同劑量組小鼠陰道內(nèi)陰道毛滴蟲密度明顯減少，于給藥第8 天，中、高劑量作用更為明顯，且陰道組織病理顯示艾葉發(fā)酵物中、高劑量組各小鼠陰道組織病變程度明顯減輕。體內(nèi)外試驗提示艾葉發(fā)酵物具有明顯的抗陰道毛滴蟲作用。但艾葉發(fā)酵物中何種成分發(fā)揮了該作用尚需進一步研究。

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