異甘草素對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠血清細(xì)胞因子的影響

楊永明，荔志云，季瑋

異甘草素對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠血清細(xì)胞因子的影響

楊永明1，荔志云2，季瑋3

目的：觀察異甘草素對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠血清干擾素γ（IFNγ）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、白介素-2（IL-2）、IL-4和IL-13的影響。方法：將45只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、治療組各15只，改良Feeney法建立大鼠腦外傷模型，假手術(shù)組僅開(kāi)骨窗不打擊。術(shù)后治療組給予異甘草素治療，假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水，均治療5 d。檢測(cè)血清中的細(xì)胞因子，測(cè)量腦含水量，觀察海馬細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果：與模型組相比，治療組MCP-1、IL-2、IL-4和IL-13含量升高（<0.05），IFNγ含量降低（<0.05），腦含水量減低（< 0.05），損傷側(cè)海馬組織病理學(xué)明顯改善。結(jié)論：異甘草素可促進(jìn)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠的恢復(fù)，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子有關(guān)。

異甘草素；創(chuàng)傷性腦損傷；細(xì)胞因子

創(chuàng)傷性腦損傷發(fā)病率高，缺少有效的治療藥物。中藥提取物異甘草素是一種黃酮類(lèi)化合物，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有多種藥理作用[1]。細(xì)胞因子在腦損傷中有重要作用，既可保護(hù)受傷的腦組織，又可加重腦組織損傷。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，干擾素γ（interferon γ，IFNγ）被認(rèn)為是神經(jīng)損害性因子[2]，白介素-2（interleukin-2，IL-2）、IL-4、IL-13、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）被認(rèn)為具有神經(jīng)保護(hù)作用[3,4]。本實(shí)驗(yàn)采用異甘草素對(duì)腦損傷大鼠進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)炎癥細(xì)胞因子的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Wistar雄性大鼠45只，由蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科提供，鼠齡2～3個(gè)月，體質(zhì)量150～200 g，在正常溫控、光照及自由攝食條件下飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑與儀器 異甘草素（純度98%）由上海源葉生物科技公司提供，蛋白芯片由Ray biotechnology公司提供。

1.2 方法

45只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、治療組各15只。

1.2.1 腦外傷模型制備 采用改良Feeney法[5]，自制打擊器，由撞桿、下落打擊棒和金屬套管三部分組成。打擊棒質(zhì)量30 g，下落高度30 cm，打擊直徑3 mm，打擊深度3 mm。大鼠用10%水合氯醛（30 mg/kg）腹腔注射麻醉后，固定頭部，消毒后于矢狀正中線切開(kāi)頭皮，分離軟組織及骨膜，用小型電鉆在左頂葉上方開(kāi)直徑約4 mm的骨窗，并保持硬膜完整。將打擊裝置垂直固定于大鼠的腦表面，打擊棒沿金屬套管從30 cm高度打擊頭部致傷（沖擊力為900 g·cm），造成左側(cè)大腦半球局部腦挫裂傷損傷。充分止血后，碘伏消毒傷口并縫合頭皮，假手術(shù)組僅開(kāi)骨窗不打擊。用1%的吐溫生理鹽水將異甘草素配置成懸液，術(shù)后2 h治療組給予異甘草素30 mg/kg腹腔注射治療1次/d，假手術(shù)組和模型組給予等量的1%吐溫生理鹽水腹腔注射1次/d，均治療5 d。

1.2.2 細(xì)胞因子和腦含水量檢測(cè) 各組任取10只大鼠，斷頭取血，分離血清，用蛋白芯片法檢測(cè)血清 IFNγ、MCP-1、IL-2、IL-4、IL-13含量。取大鼠損傷側(cè)腦組織，去除凝血，用冰冷生理鹽水沖洗腦組織表面血跡，濾紙吸去腦組織表面殘余水分，用電子天平測(cè)其濕重，然后于75℃通風(fēng)烘烤箱烘烤72 h至恒重，取出稱(chēng)干重，計(jì)算含水量：腦含水量=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.2.3 海馬切片觀察 各組取5只大鼠，斷頭取腦，用冷生理鹽水內(nèi)外沖洗腦組織，甲醛內(nèi)固定，濾紙吸去腦組織表面殘余水分，浸入4%多聚甲醛固定48 h，以損傷灶中心行腦組織切片，HE染色觀察海馬病理變化。Olympus顯微鏡放大400倍，計(jì)數(shù)各組隨機(jī)10個(gè)視野下海馬CA3區(qū)神經(jīng)元個(gè)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SSPS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，均數(shù)比較采用單因素方差分析，多組間比較采用檢驗(yàn)，<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果

治療組的IFNγ、MCP-1、IL-2、IL-4和IL-13與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05），其中MCP-1和IL-4的含量增高更加明顯（<0.01），見(jiàn)表1。

表1 3組血液細(xì)胞因子比較（pg/mL，±s）

表1 3組血液細(xì)胞因子比較（pg/mL，±s）

注：與假手術(shù)組比較，①<0.05；與模型組比較，②<0.05，③<0.01

組別只數(shù)I F N -γ M C P -1 I L -2 I L -4 I L -1 3假手術(shù)組 5 7 . 5 3 ± 0 . 4 5 2 2 1 . 6 1 ± 1 2 . 8 4 1 3 6 . 3 8 ± 9 . 8 2 1 . 4 2 ± 0 . 1 8 9 . 0 4 ± 0 . 8 8 7 . 5 3 ± 1 . 2 1①治療組 5 6 . 5 1 ± 0 . 1 2② 3 0 2 . 5 6 ± 1 6 . 3 3③ 1 2 7 . 8 1 ± 9 . 1 4② 2 . 5 9 ± 0 . 2 3③ 7 . 9 4 ± 0 . 7 3②模型組5 7 . 5 0 ± 0 . 4 0 9 5 . 2 5 ± 1 1 . 5 7①9 3 . 3 7 ± 7 . 5 6①1 . 7 8 ± 0 . 1 7①

2.2 腦含水量檢測(cè)結(jié)果

假手術(shù)組、模型組、治療組的腦含水量分別為（71.15±1.92）%、（75.53±2.13）%、（73.20±1.54）%，模型組與假手術(shù)組比較腦含水量明顯增加（<0.01），治療組與模型組比較腦含水量減少（<0.05）。

2.3 海馬組織病理切片觀察

假手術(shù)組海馬組織結(jié)構(gòu)清晰，層次分明，細(xì)胞排列整齊分布均勻，細(xì)胞數(shù)目較多，大小形態(tài)均勻，結(jié)構(gòu)良好；模型組海馬組織結(jié)構(gòu)層次欠清，細(xì)胞明顯減少，大小形態(tài)不均，可見(jiàn)較多核溶解細(xì)胞；治療組可見(jiàn)海馬組織結(jié)構(gòu)較為清晰，細(xì)胞數(shù)目比模型組明顯增多，大小形態(tài)較均一，結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常，見(jiàn)圖1。假手術(shù)組、模型組、治療組海馬CA3區(qū)神經(jīng)元計(jì)數(shù)分別為（42.61±8.27）、（16.82± 6.32）、（35.24±7.54）個(gè)，模型組低于假手術(shù)組（<0.01），治療組高于模型組（<0.01）。

圖1 假手術(shù)組（A）、模型組（B）、治療組（C）海馬組織病理（HE染色，×400）

3 討論

創(chuàng)傷性腦損傷后血腦屏障破壞，大量細(xì)胞因子釋放,外周血和腦組織之間的細(xì)胞因子相互滲透。Gong等[6]報(bào)道腦損傷后血腫內(nèi)和血腫周?chē)嬖谝灾行粤＜?xì)胞、巨噬細(xì)胞、活化的小膠質(zhì)細(xì)胞滲出為特征的炎癥反應(yīng)，并釋放多種炎性細(xì)胞因子。血液中的IL-2、IL-4、IL-13、MCP-1和IFNγ來(lái)源于淋巴細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞等。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在的IL-2及其受體能刺激少突膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和成熟，保護(hù)受損的海馬神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)元存活和軸突生長(zhǎng)[7]。IL-2還可以刺激離體垂體前葉細(xì)胞促腎上腺皮質(zhì)激素的分泌，引起皮質(zhì)醇明顯上升，發(fā)揮廣泛的抗炎作用。IL-4是重要的神經(jīng)保護(hù)因子，可抑制 TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表達(dá)[8]，抑制炎癥連鎖反應(yīng)。IL-13能抑制炎癥細(xì)胞因子和趨化因子的生成，阻止炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，減輕炎癥損害[9]。

Yamagami等[10]報(bào)道在腦損傷早期MCP-1的表達(dá)升高。MCP-1可促使單核/巨噬細(xì)胞到達(dá)炎癥部位，吞噬壞死的細(xì)胞和組織碎片。MCP-1與其受體的相互作用可趨化腦室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞向損傷或缺血部位遷移，促進(jìn)組織修復(fù)。Bemadani等[11]發(fā)現(xiàn)，在敲除MCP-1基因的顱腦損傷模型中，神經(jīng)干細(xì)胞向損傷處的遷移較對(duì)照組顯著減少。另一方面MCP-1可引起腦組織損傷，阻斷MCP-1的表達(dá)，減少單核/巨噬細(xì)胞激活，可減少缺血性神經(jīng)元損傷[12,13]。IFNγ是神經(jīng)損害性細(xì)胞因子[12]，可減少I(mǎi)L-4和IL-10的合成和釋放。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，治療組較模型組的MCP-1、IL-2、IL-4和IL-13的血清濃度顯著增高，IFNγ的含量減低。

腦組織含水量是反應(yīng)腦水腫的重要指標(biāo)，創(chuàng)傷性腦損傷后原發(fā)的血管性腦水腫和繼發(fā)的細(xì)胞性腦水腫是加重腦損傷的重要原因[14]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)治療組腦水腫程度明顯輕于模型組，海馬病理切片可見(jiàn)治療組較模型組明顯改善。Zhan等[15]報(bào)道異甘草素對(duì)局灶性腦缺血的小鼠有改善腦能量代謝的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示異甘草素可以調(diào)節(jié)炎癥因子，促進(jìn)腦組織修復(fù)。

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Effects of Isoliquiritigenin on Serum Cytokine levels in Rats after Traumatic Brain Injury

Objective:To observe the effects of isoliquiritigenin on levels of serum IFNγ,MCP-1,IL-2,IL-4 and IL-13 in rats after traumatic brain injury (TBI).Methods:Forty-five rats were randomly divided into shamoperated,model and treatment groups with 15 rats in each group.The TBI model was established with the modified Feeney's method.In the rats in the sham-operated group the skull was just window-opened but without any blow.After the operation,the animals in treatment group were given isoliquiritigenin,while the rats in the sham-operated and model groups were given the same volume of normal saline.On day 5 after TBI,the serum cytokines were measured and brain water content was determined.The morphology of neurons in hippocampus was observed.Results:When compared with the model group,the level of IFNγ in the treatment group was decreased（＜0.05）,while the levels of MCP-1,IL-2,IL-4 and IL-13 in the treatment group were increased（＜0.05）.The water content of brain in the treatment group was decreased compared to that in the model group（＜0.05）.And compared with the model group,the morphology of hippocampus was improved（＜0.05）.Conclusion:Isoliquiritigenin can promote brain tissue rehabilitation in rats after TBI,perhaps mediated by modulation of cytokines.

isoliquiritigenin;traumatic brain injury;cytokine

R741;R741.02

A DOI 10.3870/sjsscj.2014.02.006

蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院神經(jīng)外科蘭州 730050

2012解放軍總后勤科研項(xiàng)目（No.CLZ12J006）

2013-09-02

荔志云lizhiyun456@163. com