TREK-1通道活性改變對大鼠局灶性腦缺血后細(xì)胞凋亡和凋亡相關(guān)蛋白的影響

劉陽，孫謙，王偉，謝敏杰

TREK-1通道活性改變對大鼠局灶性腦缺血后細(xì)胞凋亡和凋亡相關(guān)蛋白的影響

劉陽，孫謙，王偉，謝敏杰

目的：觀察雙孔鉀通道TREK-1活性改變對大鼠局灶性腦缺血后細(xì)胞凋亡和凋亡相關(guān)蛋白的影響。方法：45只大鼠隨機分為假手術(shù)組（10只）、對照組（10只）和干預(yù)組（25只）。建立大鼠光化學(xué)腦缺血模型，假手術(shù)組不注射玫瑰紅，干預(yù)組側(cè)腦室注射不同濃度（100 μmol/L、250 μmol/L、500 μmol/L、1 mmol/L）亞麻酸（LIN），對照組注射等量生理鹽水。應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)法觀察正常生理情況下TREK-1在大腦神經(jīng)細(xì)胞中的表達，TUNEL及DAPI雙標(biāo)法檢測缺血邊緣區(qū)細(xì)胞凋亡，Western blot法檢測B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（p-erk）表達。結(jié)果：正常生理情況下，TREK-1在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中均有表達。與假手術(shù)組相比，對照組大量細(xì)胞凋亡，Bcl-2/Bax值下降，p-erk蛋白增加＜0.05）；與對照組比較，干預(yù)組細(xì)胞凋亡顯著減少，Bcl-2/Bax值上升，p-erk蛋白降低（＜0.05）。結(jié)論：TREK-1在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中均有表達。TREK-1激動劑LIN可顯著抑制腦缺血后細(xì)胞凋亡，上調(diào)Bcl-2與Bax比值，抑制erk磷酸化。

腦缺血；TREK-1；亞麻酸；凋亡

缺血性腦卒中伴隨一系列復(fù)雜的病理生理改變，包括細(xì)胞代謝與能量失調(diào)、興奮性毒物釋放、鈣超載、自由基產(chǎn)生和炎性反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡[1]。雙孔鉀通道是近年來新發(fā)現(xiàn)的鉀離子通道，其在靜息狀態(tài)下持續(xù)激活，參與維持細(xì)胞膜電位和調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性。其對四乙胺（tetraethylammonium，TEA）、四氨基吡啶（4-amino-pynidine，4-AP）等傳統(tǒng)鉀離子通道阻滯劑不敏感，但可被機械牽張、多不飽和脂肪酸、吸入性麻醉劑、溫度、pH值改變、神經(jīng)遞質(zhì)和第二信使等多種理化因素調(diào)節(jié)[2,3]。研究發(fā)現(xiàn)，雙孔鉀通道TREK-1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達廣泛而豐富[4]，在腦缺血、癲癇等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要的保護作用[5-7]。TREK-1可被亞麻酸(linolenic acid，LIN）激活并參與LIN等多不飽和脂肪酸所介導(dǎo)的神經(jīng)保護作用[8]，但LIN發(fā)揮神經(jīng)保護作用的有效安全劑量及其具體機制尚不清楚。本研究采用光化學(xué)局灶性腦缺血模型，觀察生理情況下TREK-1在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達，不同劑量TREK激動劑LIN對腦缺血后神經(jīng)元凋亡，及其凋亡相關(guān)蛋白B細(xì)胞淋巴瘤 -2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（phosphorylated extracelluar signal regulated kinase，p-erk）表達的影響，并探討可能參與的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級健康成年SD雄性大鼠45只，體質(zhì)量220～250g，由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑與材料 TREK-1兔多克隆抗體（購自以色列Alomone公司），膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、神經(jīng)元核（neuronal nuclei，NeuN）鼠單克隆抗體（購自美國Neomarker公司），Bcl-2、Bax兔多克隆抗體（購自美國Bioworld公司），p-erk兔多克隆抗體（購自美國Cell Signaling公司），β-actin鼠單克隆抗體（購自武漢博士德公司），cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG、FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（購自美國Pierce公司），HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（購自美國KPL公司），4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4,6-diamidino-2-pheny lindole，DAPI）、四氯四碘熒光素二鈉（玫瑰紅）、α-LIN（購自美國Sigma公司），TUNEL試劑盒（購自美國Millipore公司），RIPA裂解液購自碧云天公司，BCA試劑盒、ECL試劑盒（購自美國Thermo公司），SR-6N立體定位儀（購自日本Narishige公司），KL1500LCD冷光源機（購自德國Scott公司），CM1900冰凍切片機（購自德國Leica公司），GENE GENIUS凝膠成像系統(tǒng)（購自英國Syngene公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立 大鼠隨機分為假手術(shù)組（10只）、對照組（10只）和干預(yù)組（25只）。參照文獻[9]建立大鼠光化學(xué)腦缺血模型。應(yīng)用恩氟烷氣體麻醉大鼠，將大鼠固定于立體定位儀上，暴露頂部顱骨，按0.133 mL/100 g的劑量尾靜脈緩慢推注玫瑰紅（10 mg/mL），假手術(shù)組不注射玫瑰紅，注射等劑量生理鹽水。冷光源機垂直照射顱骨表面前囟后4 mm，矢狀縫旁3.5 mm區(qū)域，光照強度3 000 K，波長550 nm，照射時間20 min，術(shù)中維持肛溫（37±0.5）℃。干預(yù)組缺血前30 min側(cè)腦室注射5 μL不同濃度 [100 μmol/L(n=10)、250 μmol/L(n=5)、500 μmol/L (n=5)、1mmol/L(n=5)]的TREK-1激動劑LIN，對照組注射等劑量生理鹽水。術(shù)后在（22～25）℃空調(diào)環(huán)境中單籠飼養(yǎng)，自由進食水。

1.2.2 免疫熒光檢測TREK-1和TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 大鼠深度麻醉后斷頭取腦，－80℃異戊烷速凍，－20℃冰凍切片機切片，厚度為10 μm，貼于多聚賴氨酸包被的玻片上。4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定15 min，0.01 mol/LPBS漂 洗 后 0.25% Triton-X100破膜，10%BSA室溫封閉2 h，加入一抗TREK-1（1∶200），GFAP（1∶200），NeuN（1∶200）4℃孵育過夜。作為TREK-1的陰性對照，使用免疫肽預(yù)先阻斷一抗與抗原的特異性結(jié)合[10]，0.01 mol/LPBS漂洗后避光加入二抗cy3標(biāo)記山羊抗小鼠抗體，室溫孵育1 h。Olympus BX51熒光顯微鏡下觀察TREK-1的表達。TUNEL染色嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟操作，最后加DAPI復(fù)染細(xì)胞核。Olympus BX51熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況，每張片子隨機選取5個視野，同一曝光條件下照相，并計算TUNEL陽性細(xì)胞百分比。

1.2.3 Western blot大鼠深度麻醉后斷頭取腦，取缺血邊緣區(qū)大腦皮質(zhì)，RIPA裂解液提取總蛋白，12 000g離心20 min，取上清測量蛋白濃度，蛋白變性后制備SDS聚丙烯酰胺凝膠并加樣電泳，將蛋白轉(zhuǎn)膜至0.45 μm醋酸纖維膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，Bcl-2、Bax兔多克隆抗體（1∶500），p-erk兔多克隆抗體（1∶500），β-actin鼠單克隆抗體（1∶1 000）4℃孵育過夜，0.5% TBST漂洗（6 min×4次），辣根過氧化物酶（1∶5 000）標(biāo)記的山羊抗小鼠，辣根過氧化物酶（1∶5 000）標(biāo)記的山羊抗兔二抗室溫孵育1 h，采用ECL曝光，顯影，定影。GENE GENIUS凝膠成像系統(tǒng)成像并分析OD值，并以β-actin為內(nèi)參進行校正。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS11.0軟件分析數(shù)據(jù)，結(jié)果以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤）（±sx）表示，方差分析，＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TREK-1在星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中的表達

在正常生理情況下，TREK-1與GFAP和NeuN共表達，說明TREK-1在星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中均有表達，見圖1。

圖1 TREK-1在腦內(nèi)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達（標(biāo)尺＝50 μm）

2.2 α-LIN對腦缺血后細(xì)胞凋亡的影響

假手術(shù)組中可見極少數(shù)TUNEL陽性細(xì)胞（1.4±0.28）%；缺血3 d后對照組中TUNEL陽性細(xì)胞為（34.6±2.66）%，與假手術(shù)組相比顯著增多，主要聚集在缺血邊緣區(qū) ； 注 射 不 同 濃 度 （100 μmol/L、250 μmol/L、500 μmol/L、1 mmol/L）LIN的干預(yù)組凋亡率分別為（8.52±0.34）%、（9.07± 1.54）%、（11.38±1.35）%、（7.26±0.94）%，與對照組比較下降（＜0.05），但不同劑量LIN對減少細(xì)胞凋亡無差異，見圖2。這說明LIN可顯著減少腦缺血后梗死邊緣區(qū)細(xì)胞凋亡，且100 μmol/L～1 mmol/L濃度范圍內(nèi)的LIN對減少細(xì)胞凋亡無差異，因此后續(xù)研究中均使用濃度為100 μmol/L。

圖2 不同濃度LIN對腦缺血后神經(jīng)元凋亡的影響

2.3 LIN對腦缺血后Bcl-2、Bax、p-erk蛋白表達的影響

Western blot結(jié)果顯示，假手術(shù)組Bcl-2/Bax值為（0.983±0.044）；腦缺血后3 d對照組中Bcl-2/Bax值為（0.322±0.017），與假手術(shù)組比較下降（＜0.05）；干預(yù)組為（0.836±0.072），與對照組比較升高（＜0.05）。假手術(shù)組p-erk蛋白為（0.12± 0.03）；對照組為（1.71±0.037），erk蛋白磷酸化水平顯著增加（＜0.05）；干預(yù)組為（0.79±0.18），與對照組比較減少（＜0.05），見圖3。

圖3 LIN對腦缺血后Bcl-2、Bax、p-erk蛋白表達水平的影響

3 討論

腦缺血病理改變時，細(xì)胞腫脹、細(xì)胞內(nèi)酸化、花生四烯酸釋放等多種理化因素可激活TREK-1通道，從而使神經(jīng)元超極化，減少興奮性毒性損傷[11]。TREK-1可維持神經(jīng)元興奮性，減輕興奮毒性損傷，還功能性表達于星形膠質(zhì)細(xì)胞，維持星形膠質(zhì)細(xì)胞較負(fù)的靜息膜電位[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，生理情況下，TREK-1在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中均有表達，側(cè)腦室注射LIN可顯著上調(diào)Bcl-2與Bax蛋白水平比值，并抑制腦缺血后erk磷酸化，從而減少腦缺血后神經(jīng)元凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

雙孔鉀通道TREK-1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布，然而TREK-1在腦內(nèi)的不同細(xì)胞的表達情況仍不清楚。Talley等[12]研究報道，TREK-1主要在神經(jīng)元中表達，星形膠質(zhì)細(xì)胞不表達。筆者以往的研究表明，TREK-1不僅表達于神經(jīng)元，也表達于星形膠質(zhì)細(xì)胞[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，TREK-1與GFAP和NeuN共定位，進一步說明TREK-1在星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中均有表達。

腦缺血損傷后神經(jīng)元凋亡是主動性、程序性的死亡過程，受一系列凋亡相關(guān)基因及復(fù)雜因素的調(diào)控，其中Bcl-2蛋白家族在線粒體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的不同，Bcl-2蛋白家族可分為抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白。促凋亡蛋白主要包括Bax、Bad、Bid等，抗凋亡蛋白包括Bcl-2、Bcl-xl等。研究報道，Bcl-2和Bax的比值下降可導(dǎo)致線粒體膜通透性孔道開放，線粒體膜受損，細(xì)胞色素C釋放，Caspase-3激活，從而啟動線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑[14,15]。筆者以往的研究發(fā)現(xiàn)，抑制TREK-1通道活性可顯著增加缺氧條件下神經(jīng)元的凋亡[16]。Blondeau等[17]發(fā)現(xiàn)，靜脈注射LIN可顯著減少海馬區(qū)神經(jīng)元丟失，下調(diào)Bax蛋白表達，同樣給予TREK-1另一種激動劑溶血磷脂后可顯著減少神經(jīng)元死亡及降低其興奮性毒性[18]。此外Heurteaux等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在Trek+/+小鼠中，LIN可顯著減少腦缺血后神經(jīng)元丟失和死亡率，而在Trek基因敲除小鼠中，LIN無明顯神經(jīng)保護作用，進一步說明LIN的神經(jīng)保護作用與TREK-1通道密切相關(guān)。本研究表明，與假手術(shù)組相比，對照組腦缺血后缺血邊緣區(qū)Bcl-2/Bax值顯著下降，神經(jīng)元凋亡數(shù)目顯著增多，干預(yù)組Bcl-2/Bax值明顯上調(diào)，并減少邊緣區(qū)神經(jīng)元凋亡，推測這可能與TREK-1通道開放，細(xì)胞膜電位超極化，興奮性降低，減少興奮性毒性損傷，從而減少神經(jīng)元凋亡有關(guān)。ERKs是MAPK信號通路中研究最多之一，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡過程中發(fā)揮重要的作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，對照組p-erk蛋白表達水平顯著上升，干預(yù)組p-erk表達明顯降低，由此推測erk信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能參與LIN介導(dǎo)的神經(jīng)保護作用。

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Effect of TREK-1 Activation on Cell Apoptosis and the Expression of Apoptosis-associated Protein in Rats Following Focal Cerebral Ischemia

Objective:To investigate the effect of TREK-1 channel activity on cell apoptosis and the protein expression of Bcl-2 and Bax after focal cerebral ischemia in rats.Methods:Forty-five rats were randomly assigned into sham-operated(n=10),vehicle-treatment(n=10),and intervention groups(n=25).Photochemical ischemia was performed and sham-operated animals were given saline instead of Rose Bengal.Alpha-lineonic acid was administrated i.c.v (100 μmol/L,250 μmol/L,500 μmol/L,or 1 mmol/L).Vehicle treated animals received the same volumes of 0.9%NaCl.The cellular distribution of TREK-1 in rat brain was detected by immunohistochemical staining.Double staining of TUNEL and DAPI was performed to determine the percentage of cell death and the protein expression of B-cell lymphoma-2(Bcl-2),Bcl-2-associated X protein(Bax)and Phosphorylated Extracellular Signal-Regulated Kinase(p-erk)was detected by western blot.Results:TREK-1 immunoreactivety was expressed in the GFAP positive astrocytes and NeuN positive neurons in the cerebral cortex.Compared with sham-operated groups,the percentage of TUNEL positve cells and the phosphorylation of erk increased significantly,the Bcl-2 to Bax ratio decreased dramatically(<0.05).However,after treatment with LIN,the percentage of TUNEL positive cells and the phosphorylation of erk was reduced significantly compared to that of vehicle group,and the Bcl-2/Bax ratio was increased(<0.05).Conclusion:TREK-1 was expressed in astrocytes and neurons.TREK-1 activation with LIN remarkably inhibited the cell apoptosis and the phosphorylation of erk,and increased the ratio of protein expression of Bcl-2 and Bax following focal cerebral ischemia.

brain ischemia;TREK-1;alpha-lineonic acid;apoptosis

R741；R741.02

A DOI 10.3870/sjsscj.2014.01.003

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科武漢430030

國家自然科學(xué)基金（No.30971007）；國家自然科學(xué)基金重點項目（No.81030021）

2013-10-10

謝敏杰xiemj2000@yahoo. com.cn