Tg-SwDI小鼠的筑巢行為研究

閔喆，王淑楠，吳軍，黃曉江，方瑜，邱占東，張?zhí)K明

·論著·

Tg-SwDI小鼠的筑巢行為研究

閔喆1，王淑楠1，吳軍2，黃曉江1，方瑜1，邱占東1，張?zhí)K明1

目的：研究不同年齡組Tg-SwDI小鼠與同齡野生型（WT）小鼠筑巢行為的差異。方法：將小鼠按基因（Tg-SwDI和WT）和年齡（2～4月齡、10～12月齡、18～20月齡）分為6組，利用固有筑巢材料在群養(yǎng)小鼠家籠中進行集體筑巢行為實驗，之后利用紙巾進行個體筑巢實驗。結果：基因（F1,31=37.03，＜0.0001）和年齡因素（F2,31=3.88，＜0.05）對群體筑巢評分均有影響。Tg-SwDI小鼠與WT小鼠相比，各年齡組均有群體筑巢功能的下降。在個體筑巢實驗中，2～4月齡和10～12月齡Tg-SwDI小鼠的個體筑巢功能下降不明顯，18～20月齡組有顯著變化。方差分析提示顯著的基因（F1,135=23.64，＜0.0001）和年齡（F2,135=15.46，＜0.0001）影響。結論：Tg-SwDI小鼠可較早出現(xiàn)集體筑巢行為受損，可能反映其早期社交行為改變，與執(zhí)行功能相關的個體筑巢行為較晚才出現(xiàn)明顯下降。

阿爾茨海默?。籘g-SwDI小鼠；筑巢行為

隨著人口老齡化的加速，阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）已成為嚴重威脅人類健康和生活質量的醫(yī)學難題。圍繞認知功能下降這一核心癥狀，執(zhí)行功能受損和日常生活能力降低及行為和精神癥狀（behavioral and psychological symptoms of dementia，BPSD）等均給患者及看護者帶來了嚴重的負擔[1]。目前對AD患者的治療越來越提倡多靶點全方面管理理念，即除了對認知功能下降進行治療，還應對社交行為、情緒及精神行為異常等癥狀進行治療；治療手段除藥物治療外，還應重視護理、認知康復鍛煉等非藥物干預方法的運用[2]。目前對AD復雜臨床癥狀的機制和治療方法的研究在很大程度上有賴于動物模型來完成，AD轉基因小鼠模型的出現(xiàn)可幫助人們更好地了解AD的病理生理機制以及尋找有效的治療手段[3]。對AD轉基因小鼠行為學的研究，也不能僅局限于對學習能力和記憶力相關的認知行為研究，還應更多關注日常生活行為、社交行為和非認知行為等方面的研究。

筑巢，是小鼠常見的一種日常行為，它不僅是一種具有庇護幼崽作用的母性行為，而且是維持體溫的本能行為，群居小鼠的集體筑巢更具有社會交流性質[4]。小鼠筑巢行為的生理學基礎復雜，可能受到許多腦區(qū)和神經遞質活動的控制。近來陸續(xù)有文獻報道在幾種不同的AD轉基因小鼠發(fā)現(xiàn)筑巢行為異常，但研究結果存在一些矛盾，其病理生理機制及其在AD研究中的應用價值還有待進一步闡明。筑巢行為實驗研究方法簡便易行，且過程幾乎無創(chuàng)，可反映小鼠的社會行為和日?；顒幽芰Γ瑸檠芯緼D的動物行為學研究提供了一種新的手段。

以往的多數小鼠轉基因模型都聚焦在腦實質老年斑的模擬上，而用于研究腦淀粉樣血管病 （cerebral amyloid angiopathy，CAA）相關病理變化的模型相對較少。Tg-SwDI轉基因小鼠表達瑞典型（Swe K670N/M671L）、荷蘭型（Dutch E693Q）和愛荷華州型（Iowa D694N）3種不同的人APP突變基因，同時具有腦實質Aβ沉積與顯著的腦血管Aβ沉積，并伴有進行性加重的膠質細胞和炎性細胞增生，是一種較新的研究AD和CAA的良好模型[5]。Tg-SwDI轉基因小鼠自面世以來，科學家們對其病理學特點做了詳細的研究，發(fā)現(xiàn)相對于其他AD轉基因模型，其很早（3月齡）就在海馬下托出現(xiàn)CAA樣病理變化伴膠質細胞增生活化，隨著年齡的增長，在海馬齒狀回、丘腦、皮質、嗅球等區(qū)域均逐步出現(xiàn)Aβ沉積且進行性加重，與之相伴隨的是在巴恩斯迷宮實驗中體現(xiàn)出早發(fā)的空間學習與記憶功能下降。此后人們利用這種動物模型通過各種方法繼續(xù)研究AD及CAA的相關病理機制，并用它來探討和評價一些AD潛在治療方法的有效性和作用機理。但對于其行為學表現(xiàn)特征卻研究得并不充分。關于這種小鼠的筑巢功能的研究還未見相關報道，因此，本研究選擇3個不同年齡組Tg-SwDI小鼠和相應的野生型（wild type，WT）小鼠進行筑巢行為的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

純合子 Tg-SwDI轉基因小鼠[C57BL/6-Tg (Thy1-APPSwDutIowa)BW-evn/J]由購自美國Jackson實驗室的2對種鼠在華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心繁殖。野生型C57BL/6小鼠由購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司的4對種鼠在相同環(huán)境傳代繁殖。至本實驗開始時，Tg-SwDI小鼠與WT C57BL/6小鼠均在華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心繁殖傳代超過5代，飼養(yǎng)環(huán)境保持12∶12 h的晝夜節(jié)律，溫度保持（22±2）℃，空氣濕度約50%～60%，動物飼養(yǎng)于含刨花墊料的（28× 12×16）cm3的標準樹脂鼠籠中，足量自由攝取水和飼料。動物飼養(yǎng)及所有實驗操作均嚴格遵守華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物倫理委員會的相關規(guī)定進行。

1.2 方法

1.2.1 分組 將小鼠按基因（Tg-SwDI和WT）和年齡（2～4月齡、10～12月齡、18～20月齡）分為6組，每組21～28只，見表1。

表1 動物分組

1.2.2 群體筑巢實驗 利用固有筑巢材料在群養(yǎng)小鼠家籠中進行，每籠有相同基因型、相同年齡與性別小鼠3～5只，每組5～7籠。實驗第1天更換墊料，每籠放入刨花墊料均勻鋪開，厚度1 cm，讓小鼠適應24 h后，在第2天夜節(jié)律前2 h再均勻加入體積為（750±50）mL的刨花墊料，第3天（18 h后）觀察筑巢情況。按照4分法對筑巢質量進行評分：1分，沒有可見的巢；2分，較淺的巢，巢呈碟狀，可有缺口；3分，中等的巢，巢呈碗狀，無缺口，但高度小于小鼠的臥高；4分，很好的巢，巢呈杯狀，巢的外壁明顯高于巢外墊料，高度達到或超過小鼠的臥高。并觀察每籠中小鼠糞便的分布情況。所有小鼠由同一觀察者評分，評分時不知道小鼠的基因和年齡信息（盲法評分）。

1.2.3 個體筑巢實驗 小鼠完成群體筑巢實驗3 d后進行個體筑巢實驗。將上述群養(yǎng)的各組小鼠分成單籠（每籠1只），讓其適應單籠環(huán)境48 h后，在每籠中換入厚度1 cm的刨花墊料，夜節(jié)律前2 h均勻平鋪放入剪裁大小一致的正方形無味薄紙巾片16張（邊長4.5 cm），18 h后按照根據文獻[5]改良的4分法對筑巢質量進行評分：1分，紙片雜亂的散布在籠子各處，沒有被撕咬；2分，紙片被聚到籠子的一側，但較松散，沒有成型的巢，沒有明顯的撕咬或折疊；3分，紙片聚攏折疊呈成型但較平的巢，沒有明顯的撕咬；4分，紙片聚攏折疊成較深的巢，并被撕咬成小塊，見圖1。所有小鼠均采用盲法評分。

圖1 紙巾個體筑巢評分方法（4分法）

1.3 統(tǒng)計學處理

采用Prism軟件進行統(tǒng)計分析與圖表繪制，結果以（均數±標準誤）表示，雙因素方差分析年齡與基因因素對筑巢行為的影響，組間兩兩比較采用事后檢定，＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 群體筑巢實驗結果

基因型（F1,31=37.03，＜0.0001）和年齡（F2,31=3.88，＜0.05）對群體筑巢評分均有影響，見圖2A。Tg-SwDI小鼠與WT小鼠相比，各年齡組均有群體筑巢功能的下降。而基因型和年齡這兩個因素之間的相互作用對 筑巢 評 分 無顯 著 影 響（F2,31=0.07，＝0.93）。此外，WT小鼠的糞便多位于所筑巢的遠端，巢內很少有糞便；而Tg-SwDI小鼠糞便則分布散亂，尤以18～20月齡為甚。

2.2 個體筑巢實驗結果

與WT小鼠相比，在2～4月齡和10～12月齡，Tg-SwDI小鼠的個體筑巢功能下降均不明顯，18～20月齡才有顯著變化，見圖2B。但雙因素方差分析仍提示顯著的基因（F1,135=23.64，＜ 0.0001） 和年 齡（F2,135=15.46，＜0.0001）差異，二者相互作用的影響則無統(tǒng)計學差異（F2,135=1.32，＝0.27），見圖2。

圖2 各組群體筑巢（A）及個體筑巢（B）評分比較

3 討論

基于AD和CAA發(fā)病機制的β淀粉樣蛋白（amyloid-β，Aβ）毒性學說，產生了許多不同的異常表達Aβ的轉基因動物模型（主要是小鼠模型），這些模型一方面可部分模擬人類AD的病理表現(xiàn)，另一方面可部分模擬AD患者可能出現(xiàn)的行為異常，一個成功的AD小鼠模型二者缺一不可。這些動物模型及相應行為學實驗方法的出現(xiàn)為人類探索AD等疾病的病因及其發(fā)病機制，尋找有效的診療手段提供了非常重要的研究途徑。

筑巢是小鼠常見的日常行為，與母性行為、社交行為、體溫保持等因素有關[4]。關于AD轉基因小鼠筑巢行為的研究并不多，以個體筑巢實驗為主，且不同研究結果存在不一致性。有研究發(fā)現(xiàn)APPswe/PS1A246E雙轉小鼠6月齡即出現(xiàn)筑巢功能受損[7]。在Tg-2576小鼠，有文獻報道2～3月齡即可出現(xiàn)個體筑巢功能的下降且隨年齡增加而加重[8]。但較早的報道卻發(fā)現(xiàn)這種小鼠只有群體筑巢功能的下降而個體筑巢功能不受影響[4]。本研究在Tg-SwDI小鼠觀察到的現(xiàn)象與之相似：這種小鼠早期即可出現(xiàn)群體筑巢功能下降，但個體筑巢功能直到18～20月齡才出現(xiàn)明顯下降，提示兩種筑巢行為可能受不同因素影響，而影響個體筑巢功能的因素可能更為復雜。

群體筑巢可能更多地受社交行為的影響。當群居時，小鼠抱團睡覺，可以使體溫喪失降低到最小程度。這種抱團行為屬于社交行為，對環(huán)境的變化很敏感[4]。此前有文獻報道在AD轉基因小鼠模型可出現(xiàn)攻擊性增強[9]，筆者也觀察到某些雄性Tg-SwDI小鼠與WT小鼠相比具有更強的攻擊性，而這種同籠群養(yǎng)小鼠之間的攻擊行為顯然可能會影響群體筑巢中的協(xié)作。攻擊性增強和社交行為異常在臨床上均是AD患者的較常見癥狀[10]，群體筑巢實驗似乎可以較好地模擬這類癥狀。但目前群體筑巢實驗多用于自閉癥等精神疾病模型的研究[11]，在AD模型中的研究報道屈指可數，其機制和意義還需更多研究來闡明。

個體筑巢行為可能主要反映小鼠日?；顒拥膱?zhí)行能力[12]。既然筑巢的一個主要動機是保持體溫，由于個體筑巢實驗環(huán)境下無法再“抱團取暖”，體溫丟失更快，因此，這種情況下小鼠具有更強烈的筑巢動機，除非執(zhí)行功能下降導致無法完成筑巢。小鼠筑巢行為的生物學基礎較復雜，可能受到多個腦區(qū)和神經遞質活動的控制。目前認為AD模型鼠的筑巢功能下降可能與Aβ對相關功能腦區(qū)的神經毒性有關，有些AD小鼠在出現(xiàn)老年斑之前便有個體筑巢功能的下降，提示可溶性Aβ的毒性可造成筑巢損害[8]；但本實驗在Tg-SwDI小鼠所見以及其他一些研究的結果[4]卻發(fā)現(xiàn)個體筑巢功能的下降出現(xiàn)較晚，即在出現(xiàn)大量老年斑后才出現(xiàn)筑巢損害。而此前在3xTgAD小鼠還觀察到用棉花作為筑巢材料時，其與WT小鼠無差異[12]，而用紙巾筑巢時可觀察到筑巢行為延遲，提示筑巢材料的偏好和難易程度也可能影響筑巢結果。目前，針對不同AD模型甚至相同模型的研究結論不盡相同，可能與實驗方法、模型的基因背景和病理特點、動物飼養(yǎng)環(huán)境等諸多因素相關，其具體機制還有待進一步研究揭示。

目前針對AD模型小鼠的行為學實驗多集中在空間學習和記憶相關的認知功能方面，而關注其日?；顒雍蛨?zhí)行功能的實驗很少，筑巢實驗無疑是一個很好的選擇。筑巢一方面有助于研究AD患者發(fā)生日?；顒雍蛨?zhí)行功能下降的病理生理機制，另一方面為利用動物模型研究AD的藥物及康復治療手段提供了良好的行為學評價工具。目前已有研究發(fā)現(xiàn)一些治療AD的候選藥物，在減少AD模型鼠Aβ沉積的同時可以改善筑巢行為[13,14]。由于近年來認知康復鍛煉等非藥物干預方法在AD治療中的應用越來越引起重視，因此，筑巢實驗在利用動物模型評估豐富環(huán)境等康復訓練相關療法的研究中也將有較廣泛的應用前景[15]。有研究發(fā)現(xiàn)剝奪小鼠的筑巢材料會增加其應激反應水平[8]，而相反在群養(yǎng)雄性小鼠籠中放入棉塊（筑巢材料）可降低其攻擊性[4]。那么給AD動物模型早期提供棉塊、紙巾等筑巢材料是否可作為一種功能鍛煉方法延緩其執(zhí)行功能的下降？或者提供筑巢材料可否作為豐富環(huán)境的一部分加強其效果？如何有意識地訓練AD患者鋪床、疊被或其他日常行為從而對延緩其病情進展產生幫助？另一方面，AD相關動物模型產生筑巢行為損害的病理生理機制還有待進一步闡明；動物筑巢行為模擬AD患者日常行為能力的效度也有待進一步評估。因此，圍繞AD動物模型和筑巢行為研究還有很多工作可做。

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Impairment of Nesting Behavior in Tg-SwDI Mice

Objective:To investigate the differences in the nesting behaviour between Tg-SwDI transgenic mice and wild-type(WT)mice.Methods:Transgenic Tg-SwDI(Tg)and wild-type(WT)mice have been studied to observe their group nest-building behaviors with chip shavings and individual nest-building behaviors with paper towels.Results:The genotype（F1,31=37.03，＜0.0001）and age（F2,31=3.88，＜0.05）had effect on the group nest construction,and the same on the individual nest-building.However,there were no significant differences between Tg and WT mice until 18～20 months.Conclusion:The Tg-SwDI transgenic mice showed a worse nesting compared to WT mice at the early ages when they were group-housed.Most individually housed mice in each group showed impaired nesting behavior in old age(18～20 months).

Alzheimer disease;Tg-SwDI mice;nesting behavior

R741;R741.02

A DOI 10.3870/sjsscj.2014.01.001

1.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院神經內科武漢430030

2.鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經內科鄭州450052

國家自然科學基金（No.81271407）

2013-08-30

張?zhí)K明Suming_zhang@163. com